Презентация на тему "Клеточная инженерия. Животные"

Содержание

• 
  Слайд 1

  ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ. ЖИВОТНЫЕ.

  Лекция 9

• 
  Слайд 2

  Основные методы клеточной инженерии

  • культивирование
  • гибридизация
  • реконструкция
• 
  Слайд 3

  ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

• 
  Слайд 4

  Культуры животных.Среды для культивирования

• 
  Слайд 5

  Культуры животных. Методы культивирования

• 
  Слайд 6

  Культуры животных. Классификация по адаптации к жизни in vitro.

• 
  Слайд 7

  ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

• 
  Слайд 8

  Фундаментальные аспекты

• 
  Слайд 9

  Прикладные аспекты

• 
  Слайд 10

  ТЕСТ-СИСТЕМЫ

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

• 
  Слайд 11
  

  ПРЕИМУЩЕСТВА по сравнению с тест-системами invivo:

  • простота культивирования
  • возможности контроля и большая воспроизводимость
  • сокращение временных и экономических затрат
  • возможность прижизненного визуального наблюдения клеток, сохраняющих жизнеспособность в течение всего эксперимента, с помощью микроскопа

  ТРЕБОВАНИЯ

  стандартизация качества культуры клеток и тканей (принципы GLP для альтернативных методов: Good CellCulture Practice (GCCP))

  Культуры в тестировании

• 
  Слайд 12
  

  Культуры клеток как тест-система в доклинических исследованиях

  В системе доклинического исследования лекарственных препаратов первым этапом является оценка токсичности соединения для культуры клеток и лабораторных животных

  • GMP (GoodManufacturingPractice) – надлежащая производственная практика
  • GLP (GoodLaboratoryPractice) – Надлежащая лабораторная практика
  • GCP (GoodClinicalPractice) – надлежащая клиническая практика
• 
  Слайд 13

  СОМАТИЧЕСКИЕ ГИБРИДЫ

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

• 
  Слайд 14
  

  Получение гибридных клонов «человек-мышь»

  Клетки мыши и лейкоциты человека обрабатывают полиэтиленгликолем, образуются гетерокарионы, затем формируется гибридная клетка с ядром, содержащим хромосомы обоих родительских видов.

  В используемой селективной среде погибают мышиные клетки, не имеющие активного гена ТК1 (необходимого для биосинтеза ДНК), и лейкоциты человека, поскольку без специальных стимуляторов они invitro не делятся. Выживают только гибридные клетки, в которые лейкоциты внесли ген ТК1.

• 
  Слайд 15
  

  НА ГЕТЕРОКАРИОНАХ И СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДАХ ИЗУЧАЮТ:

  • реактивацию геномов
  • активацию и подавление экспрессии генов, роль в этих процессах ядра и цитоплазмы

  СОСТАВЛЯЮТ: карты хромосом

  Соматические гибриды. Применение.

• 
  Слайд 16

  РЕКОНСТРУКЦИЯ. СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

• 
  Слайд 17

  История открытия. Появление термина.

  1908 г. – появление термина «стволовые клетки» гистолог А.А. Максимов исследуя развитие клеток крови создал теорию стволовых клеток

  Александр Александрович Максимов

  Доклад «Лимфоцит как общая стволовая клетка различных элементов крови в эмбриональном развитии и постфетальной жизни млекопитающих» в 1909 г. в Берлине на заседании гематологов

• 
  Слайд 18
  

  История открытия. Исследования. 1960-х гг. канадские ученые Эрнест Мак-Кулох и Джеймс Тилл нашли кроветворные (гемопоэтические) стволовые клетки в костном мозге

• 
  Слайд 19
  

  История открытия. Исследования.

  1970-е гг. А.Я. Фриденштейн и И.Л. Чертков заложили основы науки о стволовых клетках костного мозга, открыв гемопоэтические и стромальные стволовые клетки («переоткрытые» в 1990-х гг. американцами)

  • Александр Яковлевич Фриденштейн
  • Иосиф Львович Чертков

  Монография «Клеточные основы кроветворения (кроветворные клетки предшественники », 1977 г.

• 
  Слайд 20
  

  История открытия. Исследования.

  1998 г. публикация статей о выделении эмбриональных стволовых клеток из бластоцисты человека

  • Джеймс Томсон в журнале Science
  • Джон Герхартв Анналах национальной академии США

  По утверждению журнала Science выделение и размножение в питательной среде эмбриональных стволовых клеток является третьим по значимости открытии в биологии (после расшифровки двойной спирали ДНК и завершении научной программы «Геном человека»).

  • Джеймс Томсон
  • Джон Герхарт
• 
  Слайд 21

  Стволовые клетки. Определение термина.

  это недифференцированные клетки, способные как к самоподдержанию, так и к дифференцировке в зрелые специализированные клетки

• 
  Слайд 22
  

  Стволовые клетки. Свойства.

• 
  Слайд 23
  

  Стволовые клетки. Свойства. Дифференцировка.

  дифференцировка большинства типов стволовых клеток происходит по принципу поэтапного иерархического созревания через промежуточные интенсивно пролиферирующие клетки-предшественники

• 
  Слайд 24
  

  Стволовые клетки.

  Классификация по способности к дифференциации.

  • Потентность– это способность стволовых клеток давать начало зрелым (специализированным, дифференцированным) клеточным линиям
  • Тотипотентные– клеткиспособные к при определенных условиях развиться до целого организма
  • Плюрипотентные – клетки способные дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка)
  • Мультипотентные– клетки способные дифференцироваться в разные типы зрелых клеток одного вида ткани
  • Полипотентные – клетки способные давать до 5 линий развития
  • Унипотентные – клетки способные дифференцироваться только в один тип клеток
• 
  Слайд 25
  

  Классификация по способности к дифференциации

  • Тотипотентные клетки: программа тотипотентности существует в ооците, зиготе и 2-8 - клеточных бластомерах.
  • Плюрипотентные клетки: клетки эмбриона и внезародышевых оболочек (до 11 дня после оплодотворения, период имплантации зародыша в стенку матки).
  • Мультипотентные клетки: до 8 недели развития эмбриона включительно.
• 
  Слайд 26
  

  • Стволовые клетки. Классификация по источнику для получения.
  • Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)
  • Фетальные стволовые клетки
  • Стволовые клетки взрослого организмаа.) Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) б.) Мультипотентныемезонхимальныестромальные клетки (ММСК) г.) Тканеспецифичные стволовые клетки
• 
  Слайд 27
  

  • Классификация по источнику выделения. Эмбриональные.
  • образуют внутреннюю клеточную массу, или эмбриобласт, на ранней стадии развития эмбриона, являются плюрипотентными, не экспрессируют HLA антигены
• 
  Слайд 28

  Эмбриональные СК

  Характеристика:

  1.могут генерировать до 300 популяций

  2.стабильный диплоидный кариотип

  3.высокая теломеразная активность

  4. минимальный фенотип

  5. рост клонами выделяют из внутренней массы бластоцистыпредимплантированного зародыша (гестация 5-10 дней)

  Получение:

  1.из бластоцисты отбирают внутреннюю клеточную массу

  2.помещают ее в чашку Петри с клетками-кормилицами

  3.культивируют несколько дней в чашке до образования колоний эмбриональных стволовых клеток.

• 
  Слайд 29
  
• 
  Слайд 30

  Фетальные СК

  частично детерминированные клетки определенных тканей сформировавшегося фетуса (гестация от 6 до 24 недель)

  Характеристика:

  • могут специализироваться в 1-3 направлениях
  • частично маркированы МНС
  • активно пролиферируют

  Получение:

  1.из абортивного материала

  2.помещают на питательные среды

  3.культивируют несколько дней в чашке до образования колоний фетальных стволовых клеток.

• 
  Слайд 31
  

  Рисунок из

  Стволовые клетки взрослого организма

• 
  Слайд 32
  
• 
  Слайд 33
  

  СК тканевые предшественники

  Тканеспецифичныепрогениторные клетки (клетки-предшественницы) – стволовые клетки, детерминированные на дифференцировку в определённый тип клеток, располагаются в различных тканях и органах, отвечают за обновление их клеточной популяции, то есть замещают погибшие клетки.

• 
  Слайд 34
  

  Стволовые кроветворные клетки

  Мультипотентные стволовые клетки, дающие начало клеткам крови:

  • миелоидного ряда (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты, тромбоциты, дендритные клетки)
  • лимфоидного ряда (Т-лф, В-лф и естественные киллеры)
• 
  Слайд 35
  

  Мезенхимальныестромальные клетки

  Мультипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и адипоциты (жировые клетки).

• 
  Слайд 36
  
• 
  Слайд 37
  

  Лимит Хейфлика

  • в клетках существует механизм
  • их старения (теломеры), который лимитирует количество клеточных делений (не более 50 - 60)
  • 2004 г. журнал NatureGenetics опубликовал результаты длительного
  • культивирования 9 линий ЭСК из коллекции NIH (национальный институт здоровья, США)
  • 8 из 9 линий на поздних пассажах (55-59) несли генетические изменения характерные для злокачественных клеток:

  • 45 % - генные мутации (делеции или амплификации) в области проонкогенов;

  • 22 % - мутации митохондриальной ДНК;

  • 90 % - увеличение метилирования генных промоторов (эпигенетические изменения).

  Вывод: терапевтическое клонирование ЭСК требует минимального числа пассажей invitro.

• 
  Слайд 38
  

  Индуцированные стволовые клетки (иСК) – клетки, полученные из каких-либо иных (соматических, репродуктивных или плюрипотентных) клеток путем эпигенетического перепрограм-мирования.

• 
  Слайд 39
  

  Стволовые клетки.Перепрограммирование.

  • SCNT– пересадка ядер, взятых из соматических клеток, в оплодотворенную
  • яйцеклетку, из которой предварительно удалено ядро
  • слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками (соматическая гибридизация)
  • модификация с помощью: генетического материала, кодирующего белковые репрограммирующие факторы (генетическая инженерия)
• 
  Слайд 40

  Стволовые клетки.Перспективы.

  Клеточная трансплантология

  Клеточная терапия

  метод позволяет преодолеть:

  • дефицит донорских органов
  • высокую стоимость трансплантации
  • опасность осложнений
  • проблемы этического характера
  • метод позволяет осуществлять:
  • тканевую и клеточную инженерию
  • косметологические процедуры
  • лечебные процедуры
  • заместительную терапию
• 
  Слайд 41

  КЛОНИРОВАНИе ЖИВОТНЫХ

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕРЕНИЯ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 9

• 
  Слайд 42

  Формы клонирования

• 
  Слайд 43

  Предыстория метода

  1938 г. – Х. Шпеман предложил эксперимент по переносу ядра

• 
  Слайд 44

  ЭКСПЕРИМЕНТ Г.В. ЛОПАШЕВА

  Георгий Викторович Лопашов (1912-2010) 1948 г. разработал метод трансплантации ядер в яйцеклетку лягушки

• 
  Слайд 45

  ЭКСПЕРИМЕНТ Р. БРИГГСА и Т. КИНГА

  Роберт Бриггс и Томас Кинг (1911-1983) (1921-2000) 1952 г. повторили и усовершенствовали метод трансплантации ядер

• 
  Слайд 46

  ЭКСПЕРИМЕНТ Дж. ГЕРДОНА

  Джон Гёрдон (1933)

  • 1962 г. использовал в качестве донора ядер специализировавшиеся клетки эпителия кишечника головастика. Выживало не более двух процентов клонированного потомства.
  • 1970-е гг. разработал метод серийных пересадок
• 
  Слайд 47

  ЭКСПЕРИМЕНТЛ.М. ЧАЙЛАХЯНА и сотр.

  1987 г. первое клонирование млекопитающих (лабораторная линия мышей-альбиносов CBWA )

  Мышку клонировали из невзрачной тушки, которая 16 лет провела в холодильнике

  Чайлахян Л.М, Вепренцев Б.Н., Свиридова Т.А., Никитин В.А. Электростимулируемое слияние клеток в клеточной инженерии //Биофизика, 1987

• 
  Слайд 48

  ЭКСПЕРИМЕНТ Я. УИЛМУТА

  • Ян Уилмут Долли (1944) (1996-2003)
  • БиллРитчи
  • КаренМайкок
  • Кейт Кэмпбэлл (1954-2012)

  Долли со своим первым ягненком Болли клонирование осуществлялось при помощи технологии ядерного переноса

• 
  Слайд 49
  
• 
  Слайд 50
  

  перенос ядра из дифференцированной клетки в неоплодотворённую яйцеклетку в энуклеированную яйцеклетку с последующей пересадкой реконструированной зиготы в яйцевод сурогатной матери

  • КЛОНИРОВАНИЕ.
  • ТРАНСНУКЛЕОГЕНЕЗ.

  Определение термина.

• 
  Слайд 51
  

  • I этап Получение ядра для трансплантации
  • II этап Получение энуклеированной клетки-реципиента
  • III этап Получение реконструированной зиготы
  • IV этап Клонирование

  ТЕХНИКА КЛОНИРОВАНИЯ

• 
  Слайд 52
  
• 
  Слайд 53

  1 Этап. Получение ядра для трансплантации

  Донорская клетка отбирается у клонируемого животного и из нее при помощи микропипетки забирается ядро

• 
  Слайд 54

  2 Этап. Получение энуклеированной яйцеклетки

  Реципиентная клетка (неоплодотворенная яйцеклетка) отобранная у животного непосредственно после овуляции подвергается энуклеации (удаление ядра)

• 
  Слайд 55

  3 Этап. Реконструирование зиготы

  ядро с хромосомной ДНК клетки-донора соединяется с лишенной генетического материала яйцеклеткой (слияние)

• 
  Слайд 56

  МЕТОДЫ СЛИЯНИЯ. МИКРОМАНИПУЛЯЦИЯ

  • тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы
  • пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора.
  • В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора
  • Зона пеллюцида – наружная белковая оболочка яйцеклетки
• 
  Слайд 57

  МЕТОДЫ СЛИЯНИЯ. ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИЯ

  • первый разряд – для слияния клеток
  • второй – для стимуляции механизма дробления
• 
  Слайд 58

  4 Этап. Процедура ЭКО илитерапевтическое клонирование

  Культивирование in vitro – реконструированный зародыш вступает в стадию дробления

• 
  Слайд 59
  

  • Бластоциста приближается к стенке матки
  • Бластоциста начинает внедряться (имплантироваться) под слизистую оболочку
  • Имплантация практически закончена
  • Предимплантационный зародыш помещают в матку суррогатной матери, либо развитие эмбриона останавливают
• 
  Слайд 60
  
• 
  Слайд 61
  

  • клонирование
  • репродуктивное
  • терапевтическое
  • создание точной копии организма с использованием его генетического материала
  • (клонирование исчезающих или вымерших видов; решение проблемы первичного бесплодия: коммерческое клонирование домашних животных и пр.)
  • метод получения клеточных культур-трансплантатов
  • (решение проблем трансплантологии; генная терапия; научные исследования в области молекулярно биологии и пр.)
• 
  Слайд 62

  Основные современные подходы при клонировании животных

  • Фрагментированиепредимплантационного эмбриона со стимуляцией последующего развития (таким путем были получены особи разных видов млекопитающих – мышей, коров, овец, лошадей)
  • Пересадка ядер предимплантационных эмбрионов в энуклеированные клетки (клонирование земноводных – шпорцевой лягушки и пр.)
  • Пересадка ядер соматических клеток взрослой особи в энуклеированные клетки (овечка Долли)
• 
  Слайд 63

  ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ

  получения клеточных культур – трансплантатов

  1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота) 2. Зигота делится надвое 3-4. Митотическое деление продолжается 5. Через 5-6 дней образуется бластоциста6. Внутреннюю часть бластоцисты (ВКМ) помещают на питательную среду для получения стволовых клеток

  7. Воздействуя химическими веществами индуцируют дифференцировку СК в клетки разного типа (например, миоциты)

  8. Предшественников миоцитов используют для клеточной терапии

• 
  Слайд 64