Презентация на тему "Ретровирусные векторы.Схема жизненного цикла ретровируса"

Содержание

• 
  Слайд 1
  

  Лекция 5

• 
  Слайд 2

  Ретровирусные векторы.Схема жизненного цикла ретровируса

  Проникновение ретровирусной частицы в клетку зависит от специфического клеточного рецептора; синтез провирусной ДНК осуществляется с помощью ревертазы; Провирусная ДНК способна интегрировать в геном делящихся клеток и передаваться по наследству вместе с клеточным геномом; В результате транскрипции провирусной ДНК образуются РНК, направляющие трансляцию вирусных белков; Вирусная РНК упаковывается в белки капсида. Оболочка вириона формируется из мембраны клетки при выходе вирусных частиц из клетки путем отпочковывания.

• 
  Слайд 3

  Устройство генома ретровируса

  Элементы с транс-функциями - гены, кодирующие следующие белки: gag - MA (матриксный), р12, CA (капсидный), NC (белок нуклеокапсида); pol- PR (протеаза), RT (обратная транскриптаза/РНКаза Н), IN (интеграза); env - SU (поверхностный gp70), TM - трансмембранный белок; Элементы с цис-функциями: ψ-последовательность - сигнал упаковки/димеризации вирусной РНК, PBS - primerbindingsite, 3’ и 5’ SS - акцепторный и донорный сайты сплайсинга, LTR – длинные концевые повторы (содержат энхансер, промотор, а также аtt- последовательности, по которым идет интеграция в геном)

• 
  Слайд 4

  Устройство ретровирусного вектора

  Удаляются гены gag, pol, env Остаются 3’-и 5’ LTR и psi- сайт. Вместо удаленных генов вставляется интересующий нас ген LTR Neor LTR Полилинкер P Ampr ori ψ

• 
  Слайд 5

  Создание упаковочной клеточной линии

  LTR env LTR pol gag Из ретровирусной ДНК удаляется последовательность сигнала упаковки Трансформируются клетки E.coli Провирусная ДНК встроится в клеточный геном. Она будет направлять синтез вирусных РНК и вирусных белков. Но сам ретровирус не будет продуцироваться (т.к. РНК неспособна упаковаться с образованием вирусных частиц).

• 
  Слайд 6
  

  Схема переноса генов с использованиемретровирусных векторов Введем вектор в упаковочную линию. Он интегрирует в геном клетки. Под контролем LTR начнется синтез векторной РНК, содержащей сигнал упаковки. Паковочная клеточная линия содержит все необходимые белки. При упаковке векторной РНК получатся псевдовирусные частицы. Они секретируются из клеток в среду.

• 
  Слайд 7
  

  Схема переноса генов с использованиемретровирусных векторов Они способны взаимодействовать с рецепторами и инфицировать клетки. Происходит обратная транскрипция векторной РНК и полученная ДНК интегрирует в геном клетки. РНК, транскрибируемая с этой ДНКсодержит интересующий нас ген

• 
  Слайд 8
  

  Бакуловирусная экспрессия 5’AcMNPV Pp Pt 3’AcMNPV Интересующий ген 5’AcMNPV – область ДНК «перед» промотером гена полиэдрина вируса множественного ядерного полиэдроза Pp – промотер гена полиэдрина Pt – сайт терминации транскрипции гена полиэдрина 3’AcMNPV – область ДНК «после» терминатора гена полиэдрина

• 
  Слайд 9
  

  Получение бакмиды Ген полиэдрина 5’AcMNPV 3’AcMNPV lacZ’ lacZ’ att Kanr ori 3’AcMNPV 5’AcMNPV lacZ’ lacZ’ att Kanr ori 3’AcMNPV 5’AcMNPV – область ДНК «перед» промотером гена полиэдрина lacZ’ – ген b-галактазидазы att – сайт интеграции Kanr – ген устойчивости к канамицину ori – сайт инициации репликации E.coli 3’AcMNPV – область ДНК «после» терминатора гена полиэдрина

• 
  Слайд 10
  

  5’AcMNPV lacZ’ lacZ’ att Kanr ori 3’AcMNPV 5’AcMNPV – область ДНК «перед» промотером гена полиэдрина lacZ’ – ген b-галактазидазы att – сайт интеграции Pp – промотер гена полиэдрина Pt – сайт терминации транскрипции гена полиэдрина Kanr – ген устойчивости к канамицину ori – сайт инициации репликации E.coli 3’AcMNPV – область ДНК «после» терминатора гена полиэдрина Gmr – ген устойчивости к гентамицину Ampr– ген устойчивости к ампицилину Tetr – ген устойчивости к тетрациклину attR Gmr Pt Pp attR Ген Tetr Ampr Гены транспозиции Бакмида Донорнаяплазмида Плазмида-помощница Получение рекомбинантнойбакмиды

• 
  Слайд 11
  

  5’AcMNPV lacZ’* lacZ’* Kanr ori 3’AcMNPV attR Gmr Pt Pp Ген attR 5’AcMNPV – область ДНК «перед» промотером гена полиэдрина lacZ’ – ген b-галактазидазы att – сайт интеграции Pp – промотер гена полиэдрина Pt – сайт терминации транскрипции гена полиэдрина Kanr – ген устойчивости к канамицину ori – сайт инициации репликации E.coli 3’AcMNPV – область ДНК «после» терминатора гена полиэдрина Gmr – ген устойчивости к гентамицину Ampr– ген устойчивости к ампицилину Tetr – ген устойчивости к тетрациклину Получение рекомбинантнойбакмиды

• 
  Слайд 12
  

  Схема интеграции клонированного гена 5’AcMNPV Pp Pt 3’AcMNPV Интересующий ген Ген полиэдрина 5’AcMNPV Pp Pt 3’AcMNPV

• 
  Слайд 13
  

  Auxin, Cytokinin - гены фитогормонов ауксина и цитокинина, которые, в свою очередь, приводят к независимой от гормонов пролиферации клеток и росту опухолей Opine – гены, кодирующие синтез опининов– источников углерода, азота для агробактерий Vir – гены вирулентности, определяющие интеграцию T-DNA региона в клетки растений Agrobacterium tumefaciens– причина корончатого галла Активаторы генов vir Экспрессия в клетках растений 200-800 т.п.о.

• 
  Слайд 14
  

  Способы интеграции гена в клетки растений коинтеграция бинарный вектор

• 
  Слайд 15
  

  Челночный вектор для эукариотической экспрессии

• 
  Слайд 16
  

  Экспрессия двух клонированных генов Стратегия 1. Создание двухвекторной системы P Pa M1 orieuk oriE Ampr P Pa Ген A P Pa M2 orieuk oriE Ampr P Pa Ген Б P – промотер Pa – сайт терминации транскрипции oriE – сайт инициации репликации E.coli orieuc – сайт инициации репликации эукариот Ampr– ген устойчивости к ампицилину M – селективный маркер

• 
  Слайд 17

  Создание конструкций для экспрессии рекомбинантного антитела

  9A8 FvL Human κ-chain Легкая цепь Тяжелая цепь 9A8 FvH Human γ1-chain

• 
  Слайд 18
  

  Экспрессия двух клонированных генов Стратегия 2. Создание бицистронного вектора P Pa M1 orieuk oriE Ampr P Pa Ген A P Pa Ген Б P – промотер Pa – сайт терминации транскрипции oriE – сайт инициации репликации E.coli orieuc – сайт инициации репликации эукариот Ampr– ген устойчивости к ампицилину M – селективный маркер

• 
  Слайд 19
  

  Создание конструкций для экспрессии рекомбинантного антитела

• 
  Слайд 20

  Трансфекция

  Временная: Высокая эффективность «Быстрая» эксперссия Достигается введением кольцевой плазмиды Стабильная: Стабильность клона Достигается введением линеаризованной плазмиды

• 
  Слайд 21

  Схематическое изображение трансфекции методом липофекции

  Lipofectamine™Reagent формирует липосому Прекомплекс ДНК + Plus™Reagentв бессыворото-чной среде клетки линии CHO, ~ 50-80% конфлюентность (рассевают за день до трансфекции) формирование комплекса липосома - ДНК (15´, RT) культуральную среду заменяют на среду без сыворотки и антибиотиков Добавление комплекса липосома-ДНК к клеткам (инкубация 3 ч, 37 Со, 5% СО2.) слияние комплекса с клеточной мембраной линейнаяДНК, впоследствии встраивается в геном клетки

• 
  Слайд 22
  

  Гены устойчивости к антибиотикам Neo(аминогликозидфосфотрансфераза) – устойчивость к ингибитору трансляции G-418 ; Puro ( пуромицин-N-ацетил трансфераза) - ацетилирует ингибитор трансляции пуромицин; Hygro - устойчивость к гигромицину. Гигромицин В – антибиотик, ингибитор белкового синтеза (влияет на рибосомный А-сайт и на транслокацию). Ген устойчивости – Hph (гигромицинфосфотрансфераза), фосфорилированиегигромицина приводит к его инактивации. Zeocin – антибиотик широкого спектра, медь-содержащий гликопептид, выделенный из Streptomyces. Механизм действия – интеркаляция в ДНК и ее деградация. Ген устойчивости - Shble (Streptoalloteichushindustanusbleomycin), кодирует белок 13.7 kDa, который связывает Zeocinи ингибирует его активность. Гены устойчивости к компонентам среды: Ген дигидрофолатредуктазы (DHFR gene) – позволяет расти вприсутствии метотрексата Tk – ген тимидинкиназы, Gancyclovir (FIAU) – нуклеотидный аналог, который селективно убивает клетки, несущие tk. Селективные маркерные гены

• 
  Слайд 23
  

  Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, с помощью негативной селекции

  HB – область ДНК гомологичная целевому участку хромосомы Neor – ген устойчивости к G418 tk – ген тимидинкиназы

• 
  Слайд 24
  

  Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, с помощью ПЦР

• 
  Слайд 25
  

  Получение мыши нокаутной по БуХЭ Ген БуХЭ HSl Neor tk2 HSr HS – область ДНК гомологичной БуХЭ Neor – ген устойчивости к G418 tk1,2 – генытимидинкиназыHSV, т.е. ганцикловир несет смерть HS tk1 HSl Neor HSr

• 
  Слайд 26
  

  Получение трансгенных мышей с использованием ретровирусов

• 
  Слайд 27
  

  Получение трансгенных мышей методом микроинъекций

• 
  Слайд 28
  

  Получение трансгенных мышей методом модификации эмбриональных стволовых клеток