Содержание
-
ЛЕКЦИЯ 10Культивирование и рост микроорганизмов
-
Д/З 4 «Основные типы питательных сред» «Методы выделения чистых культур микроорганизмов» [7] Глава 3 стр. 54-61
-
I. Требования, предъявляемые к средам
Среды должны: быть питательными, иметь оптимальную концентрацию водородных ионов – рН, обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена, быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как и внутри клетки, быть стерильными, плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию, обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов, быть прозрачными.
-
Д/3 4 II. Основные типы питательных сред 1. По исходным компонентам различают: Натуральные средыготовят из продуктов животного и растительного происхождения (например, МПБ, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельные среды, почвенный экстракт). Имеют сложный, неопределенный химический состав. Синтетические средыготовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворенных в дважды дистиллированной воде. Наиболее удобны для исследования обмена веществ организмов. Полусинтетические среды Относятся к средам неопределенного состава. Их главными составными частями являются углеводы, соли аммония, нитраты, фосфаты и т.д., а компонент неопределенного состава (кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат, гидролизат казеина идр.) содержится в относительно низких концентрациях.
-
2. По консистенции среды бывают:
Жидкие Основой является вода (отвары, экстракты (натуральные среды) или растворы химических веществ и др. компонентов (синтетические и полусинтетические)). При развитии микроорганизмы образуют суспензии, осадок или пленку. Плотные средыготовят из жидких, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин. При развитии микроорганизмы образуют колонии. Они используются для: изучения характера роста и классификации микроорганизмов, количественного учета микроорганизмов, выделения чистых культур микроорганизмов при микробиологическом анализе воздуха, воды, почвы и т.д. пересылки культур микроорганизмов на расстояние, длительного хранения культур. В качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель, среды с селикагелем. Сыпучие среды (отруби) применяют для культивирования микроорганизмов в производстве биологически активных веществ
-
3. По составу среды делят на:
Простые. К ним относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агарХоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные. Среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.
-
4. По назначению:
а) основные среды (общеупотребительные) служат для культивирования большинства патогенных микробов б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах в) элективные (избирательные) среды предназначены для выделения чистых культур микроорганизмов из среды их естественного обитания (воды, почвы, пищевых продуктов и т.п.). Они задерживают или подавляют рост сопутствующих микроорганизмов Жидкие среды называют средами накопления. г) дифференциально-диагностические среды позволяют быстро отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной. Широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии. д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. В них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов.
-
III. Приготовление сред
Требования к посуде: посуда не должна содержать посторонних веществ (например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях). лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1-2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде. большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах.
-
Общий вид реактора
-
IV. Этапы приготовлениясред:
Варка На открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром. 2) Установление оптимальной величины рНОриентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рНпользуются потенциометром, применяя стеклянные электроды в соответствии с инструкцией или компаратором (аппарат Михаэлиса), состоящим из штатива с гнездами для пробирок и набора стандартов определенного рН.
-
Компаратор (аппарат макро-Михаэлиса). 1 - вид спереди; 2 - вид сзади; 3 - схема расположения пробирок в штативе
-
3) осветление сред Производят, если при варке они мутнеют или темнеют. Для осветления в среду, подогретую до 50° С, вливают белок куриного яйца, взбитый с двойным количеством воды, перемешивают и кипятят. Свертываясь, белок увлекает в осадок взвешенные в среде частицы. Таким же способом можно вместо яичного белка использовать сыворотку крови (20-30 мл на 1 л среды). 4) Фильтрация сред Жидкие и расплавленные желатиновые среды фильтруют через влажный бумажный или матерчатые фильтры. Агаровые среды фильтруют через ватно-марлевый фильтр . Можно пользоваться бумажными или матерчатыми фильтрами, если проводить фильтрацию в горячем автоклаве или в воронках с подогревом. Фильтрацию агаровых сред можно заменить отстаиванием. 5) Разлив среды Производится в пробирки (по 3-5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрацы и бутылки не более чем на 2/3 емкости. Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100° С, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разливают в стерильную посуду.
-
Приспособления для мерного разлива сред. а - лабораторный монтаж; б - автоматический шприц-пипетка; в - дозатор; г - полуавтомат; д - автоматический дозатор
-
6) Стерилизация 1 (Жидкие среды с углеводами, белками или витаминами лучше стерилизовать с помощью бактериальных фильтров.) 7) контроль
-
7)Контрольготовых сред: а) для контроля стерильности среды ставят в термостат на 2 сут, после чего просматривают. б) химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно соответствовать указанному в рецепте). Производят в химической лаборатории. в) биологическийконтроль: несколько образцов среды засевают подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др. Хранят среды при комнатной температуре в шкафах. Некоторые среды в холодильнике.
-
ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ПОЛУЧЕНИЕ Культивирование – выращивание микроорганизмов на питательных средах. Вырастают культуры микроорганизмов. Чистая культура – культура микроорганизмов одного вида, представленная потомством одной клетки. Для выделения чистой культуры используют плотные питательные среды, на которых каждая клетка вырастает в виде изолированной колонии. Изолированная колония – потомство микроорганизмов, образовавшееся из одной клетки. Рост культуры – физиологический процесс, в результате которого увеличивается биомасса
-
ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ПОЛУЧЕНИЕ Биомасса – масса клеточного вещества данного микроорганизма. Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток микроорганизмов одного вида. Посев - внесение части исследуемого материала в стерильную питательную среду. Пересев– перенос части выросшей на питательной среде культуры микроорганизмов на другую свежую питательную среду. Элективные условия – это условия, которые способствуют развитию одной выделяемой культуры и ограничивают развитие сопутствующих микроорганизмов.
-
Для изучения морфологических и физиологических свойств определенного вида микроорганизма необходимовыделить микроорганизмы в чистую культуру(изолировать от других видов). Включает три этапа: получение накопительной культуры в элективных условиях выделение чистой культуры определение чистоты выделенной культуры
-
1. получение накопительной культуры в элективных условиях. Элективными условиями могут быть: использование элективных сред, повышенная температура для термоустойчивых форм, повышенная кислотность для кислотоустойчивых и т.д. В этих условиях происходит преимущественное накопление выделяемой культуры, а сопутствующие микроорганизмы не будут развиваться. 2. выделение чистой культуры 3. определение чистоты выделенной культуры: визуальный метод микроскопирование посев на ряд питательных сред
-
Способы культивирования микроорганизмов
Культивирование можно проводить: 1. поверхностным или глубинным, 2. периодическим или непрерывным методами, 3. в аэробных или анаэробных условиях. Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования: накопление биомассы, получение определенного продукта жизнедеятельности микроорганизма (метаболита).
-
Поверхностный метод – выращивание аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При поверхностном культивировании стараются увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. На жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок (например, в производстве лимонной кислоты). На сыпучих питательных средах поверхностным методом получают ферментные препараты.
-
Глубинный метод – осуществляется на жидких средах, в которых микроорганизмы развиваются во всей толще. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Так как микроорганизмы могут утилизировать только растворенный в воде кислород, а растворимость кислорода в воде невелика, то для обеспечения роста аэробных микроорганизмов их необходимо постоянно снабжать кислородом. Процесс подвода кислорода вглубь жидкой среды называется аэрированием.Аэрирование осуществляется путем продувания стерильного воздуха через культуральную жидкость.
-
Глубинный метод широко используется для: получения биомассы микроорганизмов (прессованные хлебопекарные дрожжи, кормовые дрожжи) Получения различных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (органических кислот, ферментов, антибиотиков, аминокислот). Глубинное культивирование продуцентов этих веществ в производстве осуществляют в специальных аппаратах в ферментаторах(объем может достигать 100 м3 (100 000 л)).
-
Преимущества глубинного культивирования: способ не требует больших площадей и громоздкого оборудования, объем ферментаторов можно увеличить за счет увеличения высоты; простота обслуживания; возможность автоматизации; удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости.
-
Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным: Периодический метод культивирования Весь объем питательной среды засевают чистой культурой и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Поскольку культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях: Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток питания и отравление вредными продуктами обмена. В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения. В течение этих фаз изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства.
-
I - лаг-фаза(фаза задержки роста). Эта фаза следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду. Микроорганизмы не размножаются. Они приспосабливаются к среде, происходит повышение содержания нуклеиновых кислот, увеличение размера. Эта стадия является подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т. е. ее росту и размножению. II - фаза логарифмического роста. Характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена. Время, необходимое для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации. В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 20-30 мин., их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16 и т. д.). Периодический метод культивирования
-
Кривая роста бактериальной культуры:I — лаг-фаза; II — логарифмическая фаза; III — стационарная фаза; IV—фаза отмирания
Периодический метод культивирования
-
III – стационарная фаза (фаза зрелости). Размножение микроорганизмов замедляется. Скорости размножения и отмирания уравновешиваются. В результате - число клеток остается постоянным. IV - фаза отмирания. Начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания). Периодический метод культивирования
-
Периодический метод культивирования
Осуществляется во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Недостаток периодического культивирования : нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной жизнедеятельности - фаза логарифмического роста - занимает небольшую часть производственного цикла.
-
Способы культивирования микроорганизмов
Метод непрерывного культивирования микроорганизмов: Культура находится в специальном аппарате. В него постоянно притекает свежая питательная среда и с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Посевной материал выращивается до стадии логарифмического роста и вносится в питательную среду. Длительность периода логарифмического роста зависит от: количества питательных веществ в среде, количества вредных продуктов обмена, выделяемых клеткой. При большой скорости притока среда быстро обновляется, питательные вещества не успевают исчерпаться, продукты обмена не успевают накопиться и культура поддерживается долго в активном состоянии, не достигая стадии отмирания. Метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом.
-
Метод непрерывного культивирования
широко используется в пищевой и микробиологической промышленности, создает возможность автоматического поддержания заданных оптимальных условий. Благодаря этому обеспечивается стандартность готового продукта при наименьших затратах.
-
При непрерывном способе культивирования культура поддерживается в какой-то фазе роста: 1. если цель культивирования - получение биомассы продуцента, то процесс целесообразно вести в режиме логарифмической фазы, когда микроорганизм способен обеспечить максимальную скорость роста популяции. Для поддержания культуры в логарифмической фазе культивирование микробной популяции проводят в условияххемостата(турбидостата). 2. Если целью культивирования является получение метаболита (например, этилового спирта) - применяется способ непрерывного выращивания в двух или нескольких последовательно соединенных аппаратах (позволяет расчленить процесс на несколько стадий).
-
Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов
Микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду. Это определяет различия в способах их культивирования. 1. Культивирование аэробных микроорганизмов: проводятна поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха; в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород (требуется постоянное аэрирование).
-
2. Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов (должен быть минимальным контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом). Микроорганизмы культивируют в замкнутом пространстве и используют физические, химические и биологические методы создания анаэробных условий: К физическим методам относится культивирование в микроанаэростате. Это вакуумный аппарат для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью (часто это такой состав: азот с 5% CO2и 10% H2). К химическим методам относится: использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород (щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na2S2O4), металлическое железо и др.). использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, аскорбиновая кислота.
-
К биологическим методам создания анаэробных условий относится: выращивание совместно с аэробными или факультативно анаэробными бактериями. Например, питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой - анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется только после полного использования кислорода аэробом. выращивание в высоком слое среды; выращивание в толще плотной среды; культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее плотности; заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.
-
Спасибо за внимание!
-
Аэробные и анаэробные бактерии предварительно идентифицируются в жидкой питательной среде по градиенту концентрации O2: Облигатные аэробные бактериив основном собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество кислорода. (Исключение: микобактерии - рост пленкой на поверхности из-за восколипидной мембраны. 2. Облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста). 3. Факультативные бактерии собираются в основном в верхнем, однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как от O2 не зависят. 4. Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум - малая концентрация кислорода. 5. Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода и равномерно распределяются по пробирке
-
Отношение к молекулярному кислороду
Рост микроорганизмов при посеве уколом (а). Рост микроорганизмов при посеве в расплавленную плотную среду (б) 1 – аэробы; 2 – микроаэрофилы; 3 – факультативные анаэробы;4 – анаэробы Строгие аэробы растут на поверхности среды и в верхнем слое, микроаэрофилы – на некотором расстоянии от поверхности. Факультативные анаэробы обычно развиваются по всей толще среды. Строгие анаэробы растут только в глубине среды, у самого дна пробирки.
-
Техника и методы посева микроорганизмов
Для посевов применяют микробиологические петли, реже - иглы и шпатели. Чаще всего для культивирования используются пробирка и чашка Петри. Универсальным инструментом для засева культуры является бактериальная петля. Помимо неё, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлёй используются градуированная и пастеровская пипетки.
-
Посев в жидкую питательную среду. Посев на поверхность плотной питательной среды (поверхностный посев): а) сплошной посев; б) посев штрихом петлей; в) посев штрихом на скошенную поверхность питательной среды петлей или иглой. 3. Посев уколом в столбик питательной среды 4. Глубинный метод посева в плотные среды.
-
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
1. Метод разведений Из исследуемого посевного материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде: 1 мл посевного материала вносят в пробирку с РПБ, из нее 1 мл переносят в следующую пробирку и так до 8-10 пробирок. 2. Чашечный метод В стерильную чашку Петри стерильной пипеткой вносят 1 или 0,1 мл исследуемого материала, заливают расплавленным и охлажденным до температуры 45-50 С РПА. 3. Метод Дригальского (метод фракционированного посева) Основан на механическом разобщении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды. 4. Метод фильтрации Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с порами определенного диаметра и разделении содержащихся в нем микроорганизмов разной величины. Применяют для отделения вирусов от бактерий. 5. С помощью нагревания Применяется для выделения чистых культур, споровых форм бактерий (гнилостные, масляно-кислые бактерии). Перед посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при 80 С в течение 20-30 мин. При этом вегетативные клетки погибают, их споры остаются живыми и при последующих высевах на плотную среду прорастают в колонии. 6. С помощью микроманипулятора – Этоприбор, который позволяет с помощью микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом.
-
1. Метод разведений
-
2. Чашечный метод
-
3. Метод Дригальского
-
4. Метод фильтрации
-
6. Микроманипулятор
-
-
Хемостат
-
Микроанаэростат
Нет комментариев для данной презентации
Помогите другим пользователям — будьте первым, кто поделится своим мнением об этой презентации.