Презентация на тему "МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ"

Содержание

• 
  Слайд 1

  МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ

• 
  Слайд 2

  Энергетический обмен (катаболизм)

  Окислительный = дыхание Бродильный = ферментативный Смешанный

• 
  Слайд 3

  Окислительный метаболизм(дыхание)

  Дыхание – процесс получение энергии в реакциях окисления-восстановления, соп-ряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донорами электронов могут быть органические (у ор-ганотрофов) и неорганические у (лито-трофов) соединения, а акцептором – только неорганические соединения

• 
  Слайд 4
  

  Если акцептором электронов является молекулярный кислород, то это АЭРОБЫ Если акцептором электронов является нитрат или сульфат, то это АНАЭРОБЫ Нитратное дыхание встречается у факультативных анаэробов Бактерии, имеющие сульфатное дыхание (Desulfovibrioи Desulfotomaculum) медицинского значения не имеют

• 
  Слайд 5

  Отношение бактерий к кислороду

  Облигатные анаэробы – не используют кислород для получения энергии. Тип метаболизма – бродильный (иcключение: Desulfovibrioи Desulfotomaculum) Строгие анаэробы. Кислород для них токсичен. Энергию получают маслянокислым брожением (например, C.botulinum, C.tetani) Аэротолерантные - не используют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере (молочнокислые бактерии)

• 
  Слайд 6
  

  Различное физиологическое отношение микроорганизмов к кислороду связано с наличием у них ферментных систем, позволяющих существовать в атмосфере кислорода. Для нейтрализации токсичных форм кислорода микроорганизмы, способ-ные существовать в его атмосфере, имеют: супероксиддисмутазу, пероксидазу, каталазу.

• 
  Слайд 7
  

  Облигатные аэробы и факультативные анаэробы имеют супероксиддисмутазу и каталазу Аэротолерантныемикроорганизмы не имеют супероксиддисмутазы, ее функцию выполняет высокая концентрация солей марганца. Перекись водорода у этих микроорганизмов разрушается пероксидазой Строгие анаэробы не имеют ни пероксидазы, ни каталазы, но супероксиддисмутаза встречается у многих анаэробов и коррелирует с их устойчивостью к кислороду

• 
  Слайд 8
  

  Супероксиддисмутаза расщепляет за-кисный радикал на перекись водорода и молекулярный кислород. Перекись водорода может расщепляться каталазой (облигатные аэробы и факуль-тативные анаэробы) или пероксидазой (аэротолерантные микроорганизмы).

• 
  Слайд 9

  Бродильный (ферментативный) метаболизм

  Ферментация (брожение) – процесс получения энергии, при котором отщеплен-ный от субстрата водород переносится на органические соединения Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.

• 
  Слайд 10

  Типы брожений

  Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов ферментации углеводов: Спиртовое Молочнокислое Муравьинокислое Маслянокислое Если для бактерий с бродильным метаболизмом источником энергии служат белки, то такие бактерии называются пептолитическими (C.histolyticum, C.botulinum)

• 
  Слайд 11

  Методы создания анаэробных условий

  Физические Химические Биологические

• 
  Слайд 12

  Физические методы создания анаэробных условий

  Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их регенерацию путем кипячения в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением да 45-50°С. После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме 10-12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий) или бескилородной газовой смесью, состоящей из 80% азота, 10% двуокиси углерода и 10% водорода. В ряде случаев используют природный (магистральный газ). Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси используют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают 5-6 г хлористого кальция, 10-12 г силикагеля или 20-30 г хлористого натрия.

• 
  Слайд 13

  Химические методы создания анаэробных условий

  Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насыщенного раствора карбоната натрия Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл свежеприготовленного 20% раствора Na2SО4 и 16% КОН. Эти реагенты связывают кислород быстрее, чем пирогаллол Для связывания остатков кислорода в предназначенный для роста анаэробов питательных средах используют вещества - редуценты, к которым относятся тиогликат натрия (0,01-0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1-3%), цистин и цистеин (0,03-0,05%), муравьино-кислый натрий (0,25-0,75%) и др. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.

• 
  Слайд 14

  Биологические методы создания анаэробных условий

  Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При этом на одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроорганизма, способного активно поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой , края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру «чудесной палочки» (Serratiamarcescens). При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта-Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SН-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием. Культуры некоторых облигатных анаэробов можно поддерживать путем пассажа на лабораторных животных.

• 
  Слайд 15

  Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

  Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта-Тароцци. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора NaCl, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24-72 ч в глубине агараизолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта-Тароцци или СКС. Метод Вейона-Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром. Из каждой пробирки разведенный материал насасывают в пастеровские пипетки, после чего запаивают их концы. После получения микробного роста пипетку надпиливают в соответствующем месте, разламывают с соблюдением правил стерильности и переносят изолированную колонию в среду Китта-Тароцци или СКС.

• 
  Слайд 16
  

  Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка размером 6Χ6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолированную колонию засевают в пробирку со средой Китта-Тароцци или СКС для получения чистой культуры. Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод «перевернутых чашек». При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином. Термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

• 
  Слайд 17

  Питательные среды для выделения анаэробов

  Среда Китта-Тароцци. Бычью печень или мясо нарезают мелкими кусочками, заливают троекратным количеством питательного бульона рН 7,2 – 7,6, кипятят 30 мин. Бульон фильтруют. Печень промывают на сите водой, распределяют в пробирки по 3-4 кусочка в каждую, заливают 7-8 мл бульона (содержит 0,5 % глюкозы). Бульон кипятят 20 мин на водяной бане. Сверху на поверхность среды наливают стерильное масло слоем 1-1,5 см. Среда Вильсона-Блера. 100 мл 3% МПА с 1% глюкозы расплавляют на водяной бане, добавляют 10 мл 20% натрия сульфита и 1 мл 8 % растовра железа хлорида. Среда Виллиса-Хоббса. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы, 1,8 мл нейтирального красного. После стерилизации добавляют 15 мл суспензии куриного желтка с физиологическим раствором и 60 мл стерильного обезжиренного молока.