Презентация на тему "Методы определения белка в тканях животных без минерализации пробы"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Методы определения белка в тканях животных без минерализации пробы

  Выполнила: Хорошавина Юлия, ТМ-41

• 
  Слайд 2
  

  ЦЕЛЬ: изучить фотометрические методы определения общего белка в мясе убойных животных без предварительной минерализации проб.

  Определение массовой доли белка методом Лоури; Определение массовой доли белка биуретовым методом; Определение массовой доли белка методами, основанными на связывании красителей; Определение массовой доли белка методами УФ- спектрофотометрии.

• 
  Слайд 3

  Подготовка проб к анализу:

  При определении массовой доли белка в образцах мышечной ткани, методом Лоури, биуретовым методом или методом, основанным на связывании красителей белками, образец предварительно тщательно измельчают сначала ножом на часовом стекле или на мясорубке, а затем на гомогенизаторе. Для приготовления щелочного экстракта 15 г гомонизированного образца взвешивают в колбе Эрленмейера вместимостью 100 см3, прибавляют 20 см3 дистиллированной воды и 10 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3. С помощью воды суспензию переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой и хранят 12 ч в холодильнике. После этого 75 см3 экстракта (из верхней части колбы) фильтруют через бумажный фильтр диаметром 15 см, удаляя первые 15 см3 фильтрата. При определении массовой доли белка в образцах мышечной ткани убойных животных методами УФ-спектрофотометрииобразцы предварительно тщательно измельчают сначала ножом на часовом стекле или на мясорубке, а затем на гомогенизаторе.

• 
  Слайд 4
  

  1 Определение массовой доли белка методом Лоури1.1Метод Лоури в модификации Дэвени и Гергей (1976 г)

  Приготовление реактивов. Реактив А: раствор Na2CO3 массовой долей 2% в растворе NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/ дм3. Реактив В: раствор CuSO4×H2O массовой долей 0,5% в растворе тартрата натрия с массовой долей 1%. Реактив С: получают смешиванием 60 см3реактива А и 1см3реактиваВ (готовят непосредственно перед определением). Реактив Д: непосредственно перед использованием реактив Фолина - Чокалтеу титруют по фенолфталеину раствором гидроксида натрия известной молярной концентрации и по полученным результатам разбавляют до концентрации раствора 1 моль/дм3.

• 
  Слайд 5

  1.1 Метод Лоури в модификации Дэвени и Гергей (1976 г)

  Порядок проведения анализа. К 0,2 см3 исследуемого раствора, содержащего 5-100 мкг белка, прибавляют 1 см3 реактива С, смешивают и через 10 мин быстро вносят 0,1 см3 реактива Д, встряхивают и оставляют при температуре 20±5°С на 30 мин, а затем снимают показания на спектрофотометре при длине волны 750 нм.

• 
  Слайд 6
  

  Построение калибровочного графика. Содержание белка в растворе определяют по калибровочному графику, который строят с использованием раствора тирозина известной концентрации. Для приготовления стандартного раствора 20 мг кристаллического тирозина растворяют в 200 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм3. Калибровочный график строят, используя растворы тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией:

• 
  Слайд 7
  

  По результатам определения строят калибровочный график (рис.1), откладывая на оси абсцисс концентрацию стандартных растворов (мкг/см3) тирозина, а на оси ординат – значения оптической плотности при 750 нм. По графику находят концентрацию тирозина, которая соответствует найденной оптической плотности. Рисунок 1 – Калибровочный график для определения белка по методу Лоури в модификации Дэвени-Гергей.

• 
  Слайд 8

  1.2 Метод Лоури в модификации Ластыть (1978 г)

  Приготовление реактивов. Реактив А: смесь растворов: Na2CO3 молярной концентрацией 1 моль/дм3, NaOHмолярной концентрацией 1 моль/дм3 и CuSO4 с массовой долей 0,5% (содержит 1% тартрата калия-натрия) в соотношении 10:5:1. Порядок проведения анализа. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2-5 см3 щелочного экстракта белков образца, приготовленного в соответствии с прописью подготовки проб, прибавляют 15 см3 раствора тартрата калия-натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. В зависимости от массового содержания азота для фотометрического определения используют 0,2 см3 приготовленного раствора. Объем доводят до 10 см3 с помощью реактива А. По истечении 30 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 750 нм. Для определения содержания азота строят калибровочный график.

• 
  Слайд 9

  2. Определение массовой доли белка биуретовым методом

  Приготовление реактивов. Биуретовый реактив: 0,9 г тартрата калия-натрия, 3 г сульфата меди и 0,5 г иодида калия растворяют в 1000 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 0,2 моль/дм3. Порядок проведения анализа. Щелочной экстракт белков объемом 2 см3 смешивают с 15 см3биуретового реактива. После 30 мин инкубирования смеси при 37°С светопоглощение измеряют на спектрофотометре при длине волны 550 нм. Контрольный метод готовят аналогично, используя вместо образца 1 см3 дистиллированной воды.

• 
  Слайд 10
  

  Построение калибровочного графика. Для построения графика готовят ряд последовательных разведений стандартного раствора белка, в качестве которого используют кристаллический сывороточный альбумин: 0,01 г белка растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, отбирают 1 см3 и доводят объем до 10 см3. С пробами из каждого разведения белка проводят биуретовую реакцию в условиях, соответствующих описанию метода, и измеряют оптическую плотность окрашенных растворов. Затем строят график D=f(c), пример которого приведен на рисунке 2. Рисунок 2 – Калибровочный график для определения белка биуретовым методом.

• 
  Слайд 11
  

  3. Определение массовой доли белка методами, основанными на связывании красителей3.1 Метод с использованием амидочерного 10В

  Приготовления реактивов. Раствор красителя амидочерного 10В: 0,6 г амидочерного 10В, 21 г лимонной кислоты и 2,5 см3 пропионовой кислоты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды. Порядок проведения анализа. Смешивают 2 см3 щелочного экстракта, содержащего мясные белки, с 25 см3 раствора красителя амидочерного 10В. После проведения цветной реакции в течение 1 ч раствор центрифугируют в течении 10 мин при 100 с-1. Абсорбцию прозрачного супернатанта определяют на спектрофотометре при длине волны 615 нм. Массовую долю белка определяют по калибровочному графику.

• 
  Слайд 12

  3.2 Метод с использованием оранжевого кислого 12

  Приготовления реактивов. Раствор красителя оранжевого кислого 12: 1,3 г очищенного красителя растворяют в фосфатном буфере молярной концентрацией 0,05 моль/дм3 и доводят объем до 1 дм3. Фосфатный буфер молярной концентрацией 0,05 моль/дм3 (pH= 1,8-1,9): 3,4 г KH2PO4, 3,4 см3H3PO4 (массовой долей 85%), 60 см3 уксусной кислоты, 1 см3 пропионовой кислоты и 2 г щавелевой кислоты растворяют в 800 см3H2O и затем доводят водой до 1 дм3. Щавелевую кислоту и KH2PO4 предварительно растворяют отдельно в горячей воде.

• 
  Слайд 13
  

  Порядок проведения анализа. К навеске пробы, содержащей около 4 г белка, добавляют из мерной колбы 250 см3 раствора лимонной кислоты концентрацией 0,1 моль/дм3 и гомогенизируют в течение 2-3 мин. Взвешивают 2-4 г разбавленного образца с точностью до 0,01 г в пробирки 50 мл, добавляют воду до 5 г, а затем 25 см3 раствора красителя, закрывают пробкой и энергично встряхивают. Оставляют на 30 мин для взаимодействия красителя с белком и агрегации образовавшихся комплексов. Если смесь мутная, то ее центрифугируют и фильтруют. Определяют концентрацию свободного несвязавшегося красителя, измеряя абсорбцию при длине волны 475 нм. Для расчета используют стандартный график, который строят на основе анализа мяса методом Кьельдаля того же состава, что и анализируемый образец. Рисунок 3 – отношение содержания свободного красителя к общему содержанию белка в образце свиной колбасы, определенному по методу связывания красителя.

• 
  Слайд 14
  

  4. Определение массовой доли белка методами УФ- спектрофотометрии4.1 Метод определения массовой доли белка в говядине

  Порядок проведения анализа. Образец массой 15г гомогенизируют с 250 см3 раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 в гомогенизаторе в течение 2-3 мин, переносят в пробирку. В пробирку добавляют 9,5 см3 раствора мочевины молярной концентрацией 8 моль/дм3 в растворе гидроксида натрия молярной концентрацией 2 моль/дм3, встряхивают, центрифугируют при частоте вращения 83 с-1 в течение 7 мин для отделения жира и измеряют оптическую плотность при длине волны 243 нм. Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или уравнение регрессии (для чего предварительно определяют массовую долю белка по методу Кьельдаля). Уравнение регрессии, например, для соленой говядины имеет вид: у=17,32х+1,025, где у – массовая доля белка, %; х- оптическая плотность (х=D при длине волны 243 нм)

• 
  Слайд 15

  4.2 Метод определения массовой доли белка в мясе птицы

  Порядок проведения анализа. Образец массой 1,5 гтщательно измельченный суспендируют в гомогенизаторе в течение 5 мин со 100 см3 раствора лимонной кислоты, затем с помощью пипетки вносят 0,5 см3 суспензии в центрифужную пробирку, добавляют 9,5 см3 раствора карбамида, содержащего гидроксид натрия, и после осторожного перемешивания центрифугируют в течение 3 мин при частоте вращения 116-117 с-1. Заполняют кварцевую кювету с толщиной светопоглощающего слоя 1 см прозрачной жидкостью и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 241 нм. В качестве контрольного раствора используют смесь из 0,5 см3 раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 и 9,5 см3 щелочного раствора мочевины. Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или приведенное выше уравнение регрессии. Пробы с различной массовой долей белка рекомендуется готовить путем смешивания гомогенизированного куриного мяса со свиным жиром в различных соотношениях.

• 
  Слайд 16

  4.3 Метод определения массовой доли белка в свинине и говядине

  Порядок выполнения анализа. Анализ проводится по той же методике (см. п. 4,2), но с использованием других длин волн и других калибровочных графиков. Возможно также использование уравнений регрессии: для свинины: у=-13,7282+63,8762х; для говядины: у=6,9999+34,8326х. Результаты определения массовой доли белка в объектах исследования с использованием метода Лоури, биуретового метода и метода связывания красителей белками рекомендуется оформлять в виде таблицы: Результаты определения массовой доли белка в объектах исследования с использованием метода УФ-спектрофотометрии рекомендуется свести в таблицу:

• 
  Слайд 17

  Заключение:

  По результатам предварительной теоретической подготовки и проведенных определений делают выводы и составляют общее заключение по работе. На базе литературных данных и результатов собственных исследований рекомендуется дать сравнительную характеристику сырья и продуктов по содержанию белка, а также прокомментировать преимущества и недостатки предлагаемых методов анализа белков мяса и мясопродуктов.

• 
  Слайд 18

  Список литературы:

  Антипова Л.В. Методы исследования мяса и мясных продуктов / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов.- М.: КолосС, 2004. – 571с. Журавсткая Н.К. исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов / Н.К. Журавская, Л.Т. Алехина, Л.М. Отряшенкова. – М.: Агропромиздат, 1985. – 296с. Химия пищи. Кн.1: Белки: структура, функции, роль в питании / И.А. Рогов, Л.В. Антипова, Н.И. Дунченко и др. – М.: Колос, 2000. – 384с.

• 
  Слайд 19
  

  Спасибо за внимание!