Презентация на тему "E. coli бактериясынан плазмидалық ДНҚ молекуласын бөліп алу"

Содержание

• 
  Слайд 1

  E. Coli бактериясынан плазмидалық ДНҚ молекуласын бөліп алу

• 
  Слайд 2

  Мазмұны:

  Плазмидалық ДНҚ-ның анықтамасы Физикалық сипаттамасы Функциялары Қолдануы Плазмидалық ДНҚ-ны экстракциялау әдістері

• 
  Слайд 3
  

  ХромосомалықДНҚ(1) жәнеплазмидалалар(2) бактерияныңжасушасында

• 
  Слайд 4

  Плазмидалық ДНҚ-ның анықтамасы

  1952 жыл, Дж. Ледербергпен «плазмида» термині енгізілді Плазмида – екі тізбекті сақиналы ДНҚ молекуласы, хромосаманың геномынан физикалық түрде бөлек тұратын және өз бетінше репликацияланатын кішкентай ДНҚ молекулалар.

• 
  Слайд 5

  Физикалық сипаттамасы

  Ковалентті супероралған екі тізбекті сақина 1 мыңнан 100 мыңға дейін жұп негіздерінен тұрады

• 
  Слайд 6

  Функциялары

  Гемолизин синтізі - Hly-плазмида Ауыр металдарға төзімділігі Антибиотикке төзімділік (R-плазмиды) Энтеретоксинніңсинтізі - Ent-плазмида Ультракүлгін сәулесіне төзімділігі; Рестрикция-модификациялы жүйесі;

• 
  Слайд 7

  Қолдануы

  Вектор ретінде гендерді тасылмалдау

• 
  Слайд 8

  Плазмидалық ДНҚ-ны экстракциялау әдістері

  Соңғы өнімнің тазалығына Экстракциянын жылдамдығына Үлкен көлемде бөлу «maxiprep», жақсысапалыпДНҚэкстрациялауболады. Төменбағалыжәне тез әдіс. Ораташа көлемде бөлу «midiprep» Кішкентайкөлемдебөліпалу«miniprep»

• 
  Слайд 9
  

  Жаңа бактериялардың культурасын 150 мл ортада 3LB+Amp 7ºС-та өсіреміз (20-24 сағат) Жасушаны лизиска ұшыру. Қайнату арқылы лизистеу (Holmes, Quigley, 1981) және сілті арқылы лизистеу (Birnboim, Doly, 1979), жоғары әсерлілігімен және аз плазмидаларға пайдалануға болатындығымен ерекшеленеді (≤10 kb) 2-3 мг/л. ЭДТА – сыртқы мембрананы босатып, нуклеаза лизоцимін ингибирлеп, клетка қабықшасын бұзады. SDS–тің әсерімен лизистеу (Godson, Vapnek, 1973) салыстырмалы жұмсақ әрі үлкен плазмидаларда қолдануға болады (≥10 kb). SDS- цитоплазматикалық мембрананы бұзып, белоктарды денатурацияға ұшыратып, нуклеазаларды ингибирлейді. Сілтілі реагент ретінде 0.2 н NaOHқолданылады.

• 
  Слайд 10

  Плазмидалық ДНҚ-ны экстракциялау әдістері. Сілтілі әдіс.

  Эксперимент кезіндегеномдықжәнеплазмидалық ДНҚ қоспасының рН-ты сілтілі жаққа өзгертеді. Осы кезде ДНҚ толығымен денатурацияға ұшырайды, бірақ палзмидалық ДНҚ өзгермейді. Оның себебі плазмидалық ДНҚ сақиналы болып келегендіктен арасындаығы байланыс сілтілі реагентерге тұрақты болып келеді.

• 
  Слайд 11
  
• 
  Слайд 12
  

  Денатурация кезеніңдепДНҚбіртізбегіжылжыптұрақтықалпысынакеледі. ҚайтымсызденатурацияланағанпДНҚсиквенскеқолдануғаболады, бірақрестриктазаферменттері оны танымайды.

  пДНҚ

• 
  Слайд 13

  Выделение pDNA (максипреп - лизис щелочью).

  растить ночную культуру 20-24 часа в 100-500ml богатой среды: 37oС, 200-300rpm; ЦФ 4oС, 10-15', слить среду; ЦФ 4krpm, 1', отсосать остатки жидкости; ресуспензировать в 10(5)ml раствора "I"; + 1(0.5)ml свежеприготовленного раствора лизоцима (10mg/ml в р-ре "I"); NT, 15'; + 20(10)ml раствора "II", вылить резко, смешать: 0oС, 5'; + 10(5)ml холодного 10М AcONH4 (добавлять 5 ml пипеткой по каплям), смешать; 0oС, 5'; ЦФ 5krpm, 4oС, 10'; супер снять, разделить на 2 пробирки, добавить к каждой по 12.5 mlизопропанола. Делать это на весах, чтобы пробирки имели равный вес; NT, 10'; ЦФ 5krpm, 4oС, 10', сбросить супер; ЦФ NT, 3', отсосать остатки жидкости (не подсушивать); cуспендировать осадок в 800µl 2 M AcONH4, объединить в одной 2ml пробирке; NT, 5'; ЦФ NT, 10'; cупер перенести в пробирку с 800µl изопропанола; NT, 5'; ЦФ NT, 5'; сполоснуть 70% EtOH; растворить в 0.2-1ml H20.

• 
  Слайд 14
  

  растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37oС, 200-300rpm; 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 30'', удалить супер; п.2. - ещё 2 раза; ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды; ресуспензировать осадок в 200µl раствора "I", вортекс 5''; NT, 5'; + 400µl раствора "II", резко вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз; 0oС , 5' (не больше!!!); + 200µl холодного 10М AcONH4, ~5 раз перевернуть; 0oС, 5'; ЦФ NT, 5'; супер перенести в пробирку с 500µl изопропанола, смешать; NT, 10'; ЦФ NT, 10', сбросить супер; ЦФ NT, 0.5-1', сбросить остатки изопропанола (не подсушивать); + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20''; NT, 5'; ЦФ NT, 5', перенести супер в пробирку со 100µl изопропанола; NT, 10'; ЦФ NT, 10'; сполоснуть осадок 70% EtOH (~200µl), подсушить растворить в 25µl (H20 или TE). Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью).

• 
  Слайд 15

  пДНҚ экспресс-әдіспенбөлу

  Векторға енгізілген генді не фрагментті тексері үшін, не плазмиданың көлемін өлшеу үшін қолдануға болады. растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37oС, 200-300rpm; 0.2ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку; ЦФ 30'', удалить супер; ресуспензировать осадок в 40µl 1х TE (или TAE), вортекс 5''; добавить:40µl Ф:Х,4µl 10х SDS(+)-буфера для внесения; вортекс 20''; ЦФ 5'; 15-20µl водной фазы на форез.

• 
  Слайд 16

  Экстрацияланған пДНҚ центрафугамен тазарту

  Взять 0.2-1.0mg pDNA, довести объём до 540µl (H2O или TE), Добавить0.800g CsCl;60µl EtBr 10mg/ml; Смешать, NT, 5'; ЦФ NT, 10'; Перенести водную фазу в полипропиленовую ультроцентрифужную пробирку для ротора TLS-55; наслоить поверх последовательно по 0.73ml растворов "p2" и "p1"; Уравновесить пробирки (вместе с бакетами) попарно на точных весах (с точностью до 1mg); ЦФ на Optima TL-100 (Beckman) 55krpm, NT, >12h (лучше ~24h); Собрать в 1-2ml шприц суперскрученнуюpDNA (нижняя полоса), перенести в 1.5ml пробирку; Несколько раз (до исчезновения окраски) экстрагировать раствором "изопропанол /CsCl"; Очистка от CsCl: Разбавить H2O в 3 (а лучше в 6) раз и осадить 1х объёмом EtOH (мягко смешать, преципитат промыть 75% EtOH, дважды перенося типом в новую пробирку); Подсушить, растворить в H2O или TE, спектрофотометрически определить концентрацию.

• 
  Слайд 17
  

  пДНҚ хлорид цезиясымен (CsCl) жәнеэтидиумбромидпен (EtBr) аралысады. EtBrекітізбекті ДНҚ молекуласынаенеді (интеркаляцияғаұшырайды), осы кездеДНҚныңбаусыздануыжүреді. EtBrинтеркаляцияғабайланысты ДНҚ тығыздығыазаяды, сондықтантізбектіДНҚмызковаленттібайанысқансақиналыДНҚғақарағандасалмағыазаяды, өйткеніEtBrсақиналытізбекпен аз мөлшеріғанабайланысады. Салмағынадағыайырмашылықболғандықтанекеуібірбіріненажырасылады. Интеркаляцияпроцессі ДНҚ молекуласыныңгеометриясынөзгертіпақуыздарданбосатуынанкөмектеседі.

• 
  Слайд 18