Презентация на тему "ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ"

Содержание

• 
  Слайд 1

  ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ

  Структура и методы анализа ДНК

• 
  Слайд 2

  Нуклеиновые кислоты

  1869 году Фридрих Мишер, обнаружил новый класс органических соединений – нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты – природные высокомолекулярные органические соединения, обеспечивающие хранение и передачу наследственной (генетической) информации в живых организмах. Нуклеиновые кислоты представляют собой макромолекулы, образованные повторяющимися структурами – нуклеотидами.

• 
  Слайд 3
  

  Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов: циклического азотсодержащего соединения, называемого «основанием», сахара пентозы, включающего пять атомов углерода, и фосфорной кислоты. Известны пять главных азотистых оснований. Одно из них, урацил (2,6-оксипиримидин), обнаруживается только в РНК. Другое, тимин (2,6-окси-5 метилпиримидин), находится как правило, только в ДНК. Остальные три основания: цитозин (6-амино-2оксипиримидин), аденин (6-аминопурин) и гуанин (2-амино-6-оксипурин) – присутствуют как в ДНК, так и в РНК. Двуциклические основания – аденин и гуанин – относятся к пуринам, моноциклические основания – цитозин, тимин и урацил – к пиримидинам. Тимин отличается от урацила наличием метильной группы (-СН3), которая отсутствует в урациле. Сахар пентоза, входящий в состав РНК, является рибозой, а входящий в состав ДНК – 2-дезоксирибозой. Часть нуклеотида, состоящая из сахара с присоединенным к нему азотистым основанием называют – нуклеозид. Поэтому нуклеотиды называются также нуклеозидмонофосфатами.

• 
  Слайд 4
  

  ДНК. Нуклеотидный состав ДНК впервые в 1905г. проанализировал Э. Чаргафф. Стало известно, что 4 основания присутствуют в ДНК. Молекула ДНК имеет более сложную структурную организацию. Существенное значение для понимания строения ДНК имели установленные Э. Чаргаффом закономерности, в соответствии с которыми в любой молекуле ДНК: Сумма нуклеотидов, содержащих пуриновые азотистые основания, равна сумме пиримидиновых нуклеотидов, т.е. А+Г=Т+Ц Содержание аденина (А) равно содержанию тимина (Т), а содержание гуанина (Г) – содержанию цитозина (Ц), т.е. отношение А к Т и Г к Ц равно 1. Количество оснований с кетогруппой в 6-м положении равно количеству оснований с аминогруппой в 6-м положении, т.е. Г+Т=А+Ц, или (Г+Т) / (А+Ц)=1. Эти правила выявили устойчивую взаимосвязь содержания Т и А с одной стороны и Ц и Г – с другой.

• 
  Слайд 5
  

  Большую роль в расшифровке строения ДНК сыграло рентгеноструктурное исследование, проведенное (1953) М. Уилкинсом и Р. Франклин. Оно показало, что ДНК – упорядоченная структура, состоящая из повторяющихся нуклеотидов, расположенных вдоль оси молекулы на расстоянии 0,34 нм друг от друга, а на один виток спирали их приходится 10. Диаметр молекулы ДНК составляет около 2 нм.

• 
  Слайд 6
  

  Дезоксирибонуклеиновые кислоты представляют собой единственный тип молекул, способных к самовоспроизводству или репликации, что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений. Записывается последовательность ДНК слева направо (5-3) первыми заглавными буквами соответствующих нуклеотидов, являющихся одновременно единицами измерения молекулы. Размеры ДНК могут меняться в гигантских пределах: от нескольких нуклеотидов до миллиардов пар оснований (п.о.). В качестве единиц измерения размеров ДНК используют также килобазы (kb) и мегабазы (Mb) – последовательности, соответствующие тысяче и миллиону пар оснований соответственно.

• 
  Слайд 7
  

  Водородные связи между парами нуклеотидов достаточно непрочны, так что цепи ДНК могут легко диссоциировать – разделяться и ассоциировать – соединяться при изменении температуры или солевых концентраций. При каждом цикле ассоциации-диссоциации или, как еще говорят, отжиге-плавлении будет точно воспроизводиться двухнитевая структура – дуплекс, устойчивость которого определяется соответствием нуклеотидных пар. Процесс образования дуплексов носит название - Гибридизации.

• 
  Слайд 8
  

  Схема реализации однонаправленного потока информации ДНК-РНК-белок составляет основу молекулярно-биологической догмы. Репликация ДНК РНК мРНК Белок ген

• 
  Слайд 9
  

  Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекулы ДНК путем преципитации в этаноле. Из 1 г сырой ткани или из 109 клеток обычно получают 2 мг ДНК.

• 
  Слайд 10
  

  У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови. Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядерные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих денатурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК дает применение протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией разрушением белков. ДНК осаждают в этаноле и растворяют в буферном растворе.

• 
  Слайд 11
  

  Оценку качества ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280)>1,8 где А(260) и А(280) – оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно.

• 
  Слайд 12
  

  В процессе сложного и многообразного функционирования различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные регулируемые и в основе своей обратимые изменения. Эти модификации осуществляются с помощью ферментов. Мы ознакомимся только с двумя классами ферментов: ДНК-полимеразами и Рестриктазами.

• 
  Слайд 13
  

  Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК-полимеразами. И в бактериальных клетках, и в клетках эукариот содержатся три различные формы ДНК-полимераз, все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК в направлении 5-3, последовательно прибавляя по одному нуклеотиду к 3-ОН-концу цепи, причем точность синтеза определяется комплементарностью. Таким образом, для работы ДНК-полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с двухнитевым участком на 3-конце молекулы. Кроме того, в середине должны присутствовать четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) – молекул, состоящих из основания – А, С, G и T, сахара –дезоксирибозы (d) и трех (Т) фосфатных остатков (Р).

• 
  Слайд 14
  

  У эукариот репликацию осуществляет ДНК-полимераза А. ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3-5, что позволяет им исправлять – Репарировать – дефекты, допущенные при подборе комплементарных оснований. ДНК-полимераза E.coli способна инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом НИК-ТРАНСЛЯЦИИ.

• 
  Слайд 15
  

  Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью – рестрикционных эндонуклеаз, или рестриктаз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и возможности генной инженерии. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознавания и защиты «своих» и уничтожения чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей - называемых сайтами рестрикции.

• 
  Слайд 16
  

  Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов – характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность.

• 
  Слайд 17
  

  Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соответствующими первым трем буквам латинского названия вида бактерий. В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают три класса рестриктаз: часто средне редкощепящие Естественно, что рестриктазы, узнающие длинные специфические последовательности (8-12 п.о.), как правило, являются редкощепящими, а узнающие короткие – (4-5 п.о.) – частощепящими.

• 
  Слайд 18

  Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

  Предложенный в 1983 г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г., альтернативный метод анализа геномной ДНК – метод полимеразной цепной реакции – явился эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века.

• 
  Слайд 19
  

  Метод ПЦР (специфической амплификации ДНК) позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, реже до 1000-2000 п.о., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.

• 
  Слайд 20
  

  Условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными Праймерами – олигонуклеотидными последовательностями ДНК длиной обычно от 15 до 30 п.о., комплементарными 3-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул.

• 
  Слайд 21
  

  Успех в разработке метода ПЦР связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

• 
  Слайд 22
  

  Схема ПЦР Исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей 95-98 С. Дальнейшая схема заключается в чередовании циклов: - гибридизация, или отжига, ДНК с праймерами; - синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК; - денатурация образовавшихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до 30-50С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам.

• 
  Слайд 23
  

  Работа ДНК-полимеразы, 60-70С начинается синтез ДНК в направлении 5-3 с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до 80-90 С синтез прекращается, и двухнитевой участок между матричными и синтезированной молекулой ДНК расправляется (денатурирует). В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режимам, а по достижении ДНК-полимеразной границы амплифицированного участка, что и определяет, в конечном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.

• 
  Слайд 24
  

  Таким образом, при каждом цикле происходит двухкратное увеличение числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК, и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами – температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапазоне от десятков секунд до 1-3 мин, так что полный цикл длится от одной до нескольких минут. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

• 
  Слайд 25
  

  ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы – термоциклеры или амплификаторы ДНК. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла

• 
  Слайд 26
  

  Все компоненты реакции – матричную ДНК, олигопраймеры, смесь dNTP и термофильную ДНК-полимеразу добавляют в специальный буфер, наслаивают небольшое количество вазелинового масла для предотвращения высыхания раствора, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительность каждого шага реакции. Общий объем реакционной смеси обычно составляет от 10 до 50-100 мкл. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка.

• 
  Слайд 27
  

  В качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищенной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, соскобы с цитогенетических препаратов, патологоанатомические анализы и длительно фиксированные ткани.

• 
  Слайд 28
  

  Существуют разлные модификации ПЦР, которые используются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера анализа амплификатов. Для трудноамплифицированных участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два этапа, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации, или доамплификации, продукты ПЦР, синтезированные на первом этапе.

• 
  Слайд 29
  

  Мультиплексная ПЦР - одновременная амплификация нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые dNTP. Как правило, амплифицированную ДНК можно наблюдать в проходящем УФ свете путем обычного окрашивания геля бромидом этидия.

• 
  Слайд 30
  

  Банк генетического материала С развитием молекулярно-генетических технологий возникла необходимость сбора и сохранения генетического материала. Оптимальным был признан способ сохранения ДНК в виде банка, который представляет собой систему хранения образцов нуклеиновых кислот (American Society or Human Genetics, Ad the Committee on DNA technology, DNA Banking and DNA analysis: Points to Confider ,1998).

• 
  Слайд 31
  

  Базовый образец ДНК, выделенный с использованием протеиназы К Резервный образец крови объём 1,5 мл Рабочий образец ДНК, выделенный "экспресс-методом" Схема банка ДНК и биологического материала

• 
  Слайд 32
  

  Для каждого человека банк должен содержать 3 единицы хранения: 1. Образец ДНК, выделенный с помощью высокопроизводительного метода с использованием протеиназы К (основной образец) 2. Образец ДНК, выделенный "экспресс-методом" (рабочий образец) 3. Образец крови объёмом 1,5 мл (резервный образец).

• 
  Слайд 33
  

  Выделение ДНК Экспресс-метод выделения ДНК 1. Кровь забирать в вакуумный контейнер "Vakuette" c ЭДТА. 2. Из вакуумного контейнера отобрать 0,7 мл крови в пробирку типа "Эппендорф" объёмом 1,5 мл. 3. В пробирку "Эппендорф" с кровью добавить раствор 1х SSC. 4. Центрифугировать 2 мин. на микроцентрифуге при 10 тыс. об./мин. 5. Надосадочную жидкость слить через край не до конца. 6. В пробирку добавить 1,4 мл 1x SSC и хорошо ресуспензировать осадок. 7. Центрифугировать на микроцентрифуге в том же режиме. 8. Повторить пункт 5. Оставшуюся каплю на краю пробирки промокнуть фильтровальной бумагой. 9. К осадку добавить 270 мл 0,2% М ацетата натрия (рН 7). Хорошо разбить осадок на шейкере. Затем добавить 30 мл 10% SDS, еще раз перемешать. Инкубироватьпри 37°С один час. 10. В пробирки добавить 500 мл смеси фенол-хлороформ (1:1). Аккуратно перемешать 10 мин. до образования однородной смеси.

• 
  Слайд 34
  

  11. Центрифугировать на микроцентрифуге при 12 тыс. об./мин. 20 мин. 12. Супернатант отобрать в чистую пробирку "Эппендорф", не захватывая интерфазу. 13. В пробирку с отобранной жидкостью добавить 1 мл 96% спирта. Плавными вращательными движениями руки "наматывать" ДНК саму на себя до появления небольшого белого комочка. 14. Центрифугировать 5 мин. на микроцентрифуге при 12 тыс. об/мин., чтобы комочек прилип ко дну. 15. Слить спирт через край. Добавить 70% спирта, перемешать, отцентрифугировать, чтобы снова приклеить комочек. 16. Слить спирт, вытрясти его остатки, контролируя наличие ДНК на дне пробирки. Промокнуть фильтровальной бумагой края пробирки и оставить сохнуть на 20 мин. 17. Осадок растворять в 50 мл деионизованной воды.

• 
  Слайд 35
  

  Стандартный метод выделения ДНК 1. Кровь забрать в вакуумный контейнер "Vakuette" c ЭДТА. 2. Перелить в пробирки объёмом 50 мл и смешать с холодным буфером для гемолиза (EL). При объёме крови 5-10 мл, необходимое количество буфера составит 45-50 мл. 3. Инкубировать в ледяной бане 15 мин., периодически перемешивая содержимое пробирок. 4. Центрифугировать 15 мин. при 2000 об/мин. при 4°С. 5. Супернатант убрать водоструйным насосом, оставив 1 см над осадком. 6. Ресуспензировать осадок в оставшемся объёме. 7. Добавить 45 мл EL и центрифугировать в том же режиме. 8. Супернатант слить через край одним движением руки. Горло пробирки промокнуть фильтровальной бумагой так, чтобы удалить остатки буфера. 9. К осадку добавить лизирующий буфер (LB). На 5 мл крови – 4 мл буфера. Ресуспензировать осадок и перелить содержимое в пробирку объёмом 15 мл. 10. Инкубировать в термостате при 56°С минимум 5 часов, лучше в течение ночи.

• 
  Слайд 36
  

  11. После инкубации в пробирки добавить фенол в соотношении 1:1 к объёму содержимого. Хорошо, но осторожно перемешать содержимое 10 мин. до образования однородной эмульсии. 12. Центрифугировать 15 мин. при 3 тыс. об./мин. 13. Верхнюю фазу осторожно отобрать в чистую пробирку, не забирая интерфазу. 14. К отобранной жидкости добавить смесь фенол/хлороформ 1:1. Хлороформ при этом должен быть с изоамиловым спиртом в отношении 24:1. Хорошо, но осторожно перемешать 10 мин. 15. Центрифугировать в том же режиме. 16. Верхнюю фазу отобрать в чистую пробирку и добавить к ней столько же хлороформа с изоамиловым спиртом. Хорошо перемешать и центрифугировать. 17. Верхнюю фазу отобрать, добавить к ней 5 М натрий хлор из расчёта 20 мкл на 1 мл полученной жидкости. 18. Затем добавить 96% спирта 2 объёма (на 5 мл раствора ДНК 10 мл спирта). 19. Кусочек ДНК переложить с помощью микропипетки в пробирку "Эппендорф" на 1,5 мл. Добавить в него 1 мл 70% спирта для отмывки солей. Спирт слить так, чтобы "кусочек" ДНК остался в пробирке. 22. Залить деионизованной водой в зависимости от величины "кусочка" ДНК в количестве от 100 до 500 мкл.

• 
  Слайд 37
  

  Исследование больных раком желудка на наличие мутаций в гене CDH1. При изучении первичной структуры ДНК гена CDH1 у больных РЖ мутаций в данном гене CDH1 обнаружено не было, но было выявлено 3 редких однонуклеотидных варианта: 1896С>T в 12 экзоне; 2253C>T в 14 экзоне и 531+10G>C в 4 интроне (рис.1). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 экзон 14 экзон

• 
  Слайд 38
  

  Мутации в генах MLH1 и MSH2 у больных с РЖ и с разной частотой рака толстой кишки и РЖ в семье.

• 
  Слайд 39
  

  Рисунок 2. Электрофореграмма РНК, выделенной AxyPrep Total RNA (Axygen, USA) из опухоли желудка. Видны бэнды: 28 S и18 S рибосомальной РНК 28 S 18 S

• 
  Слайд 40
  

  Рисунок 3. Концентрация РНК в опухоли больной Л3 до лечения (1) 48 нг/мкл и больной К1 до лечения (2), А260/А280= 2,31.

• 
  Слайд 41
  

  Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация insitu. Одним из эффективных методов идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является блот-гибридизации. Суть метода – рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами, после чего образующиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума.

• 
  Слайд 42
  

  Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивно меченым ДНК или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридизация – высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. При длительной экспозиции (в течение нескольких дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда этот метод позволяет выявлять следовые ДНК. Так, при использовании зонда размерами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 1000 п.о. может быть выявлена в 10 мкг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на авторадиографе после его экспозиции в течение 12 ч. Метод позволяет работать и с очень короткими олигонуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра.

• 
  Слайд 43
  

  Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза - дот или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна на фильтре – округлой или продолговатой. Методом гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозен-блот, тогда как Вестерн-блот, или иммуноблот, - это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с меченными антителами. Название этих методов – в честь молекулярных генетиков проф. Э. Саузерна.

• 
  Слайд 44
  

  Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизация in situ.

• 
  Слайд 45
  

  Вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называется FISH (fluorescein in situ hybridization). Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференци­ально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатуриро­ванных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК.

• 
  Слайд 46
  

  Важное значение имеет также подбор условий, максимально способствующих процедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК-зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных использо­ванному ДНК-зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответствующими участками определенных хромосом.

• 
  Слайд 47
  

  Гибридизация in situ выявляется одним из наиболее эффективных мето­дов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения, при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутрихромосомной локализации уникальных генов в тех случаях, когда имеются соответствующие ДНК-зонды.

• 
  Слайд 48
  

  Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-зондами проводится на гистологических препаратах и является одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК. Рис.4. Экспрессия Ki-67 в ядрах опухолевых клеток при аденокарциноме желудка. Ув. 200. Окр.: иммуногистохимическая реакция с докраской гематоксилином Майера.

• 
  Слайд 49
  

  Рис.5 Экспрессия Bcl 2 в цитоплазме клеток инфильтрирующих строму опухоли при аденокарциноме желудка. Ув. 200. Окр.: иммуногистохимическая реакция с докраской гематоксилином Майера. Рис.6 Экспрессия Р57 в ядрах опухолевых клеток и в ядрах клеток инфильтрата при аденокарциноме желудка. Ув. 200. Окр.: иммуногистохимическая реакция с докраской гематоксилином Майера.