Презентация на тему "Исследование белков и пептидов методами масс-спектрометрии maldi"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Исследование белков и пептидов методами масс-спектрометрии MALDI

  Д.А. Фармаковский, Shimadzu Europa GmbH

• 
  Слайд 2
  

  Масс-спектрометрия MALDI: история Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry- Лазерная десорбция/ионизация при содействии матрицы + времяпролетная масс-спектрометрия разработанов 1980-хKaras & HillenkampиК. Tanaka с соавторами Нобелевская премия по химии K. Tanaka, 2002

• 
  Слайд 3
  

  3 Масс-спектрометрия MALDI-TOF: основные принципы десорбция ионизация ускорение разделение детектирование

• 
  Слайд 4

  Ионизация MALDI

  + + + + + + MALDI подложка Смесь Аналит/Матрица УФ лазер + + + + + +

• 
  Слайд 5
  

  N O H O O H 4-hydroxy-picolinic acid m = 139.05 Da N H 2 O H O anthracinic acid m = 137.05 Da Отрицательная ионизация O H O O H N a-cyano-4-hydroxy- cinnamicacid (HCCA) m = 189.07 Da O H O H O H O 2,5-dihydroxy- benzoic acid (DHB) m = 154.03 Da Положительная ионизация sinapic acid (SIA) m = 224.07 Da Низкомолекулярные органические кислоты: поглощают УФ, доноры протонов Матрицы для MALDI

• 
  Слайд 6

  Линейный времяпролетный масс-анализатор (TOF)

  диапазон масс до 350 КДa высокая чувствительность низкая величина разрешения по массам разрешение по массам в основном зависит от геометрических размеров времяпролетной трубы – чем длиннее путь пролета ионов, тем выше разрешение

• 
  Слайд 7

  Времяпролетный масс-анализатор с рефлектроном (TOF reflectron)

  диапазон масс до 50 Кдa использование рефлектрона существенно увеличивает путь пролета ионов без увеличения геометрических размеров прибора высокое разрешениепо массам уникальный рефлектрон искривленного поля обеспечивает бесступенчатую регистрацию фрагментарных ионов

• 
  Слайд 8
  

  8 Масс-спектрометрия MALDI-TOF: диапазоны масс 2.000 20.000 500

• 
  Слайд 9
  

  Масс-спектрометрия MALDI-TOF: преимущества метода Широчайший диапазон масс анализируемых соединений: от сотен Да до 500 КДа Возможность анализа высокомолекулярных соединений без разрушения молекулы. Высочайшая чувствительность: от 10-12 до 10-21моль исследуемого вещества Высокая толерантность к солям В ходе ионизации образуются в основном однозарядные ионы, что значительно облегчает интерпретацию масс-спектров Возможность работы с многокомпонентными смесями Возможность получения информации о структуре анализируемых соединений при использовании MС/MС-анализа

• 
  Слайд 10
  

  Леддерноесеквенированиеde novo: angiotensin I (DRVYIHPFHL), гидролизат (карбокисипептидаза) Ферментативный гидролиз амидных связей пептида Масс-спектрометрический анализ продуктов реакции Разница в массах соответствует массе аминокислотного остатка

• 
  Слайд 11
  

  0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 (M+H)+ b2 b3 b4 b5 b6 b7 Секвенирование пептидов (PSD) Низкоэнергетическая фрагментация пептидов за пределами источника ионизации

• 
  Слайд 12
  

  Секвенирование пептидов (HE-CID)

• 
  Слайд 13
  

  Фрагментация боковых цепей пептидов за счет высокоэнергетической соударительной диссоциации – дифференциация изомеров и изобаров, например, лейцина и изолейцина

  Loss indicative of Leu (Ile would be -45) Секвенирование пептидов (HE-CID)

• 
  Слайд 14

  Дифференциациялейцина и изолейцина

  Фрагментация боковых цепей пептидов за счет высокоэнергетической соударительной диссоциации (HE CID) – дифференциация изомеров и изобаров, например, лейцина и изолейцина

• 
  Слайд 15
  

  Определения массы не достаточно для точной идентификации (множество различных белков имеют близкую молекулярную массу ) Предварительное разделение (2D электрофорез) Экстракция «пятна» из геля Гидролиз экстракта трипсином МС или МС/МС Triosephosphate Isomerase Saccharomyces Cerevisiae (baker's yeast) 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 Масса/Заряд 1439.84 2327.14 1768.03 1444.72 1050.56 1774.88 2295.20 1957.16 2039.08 2519.28 2002.05 2345.26 2391.30 1618.91 1440.26 Идентификация белков и пептидов

• 
  Слайд 16
  

  Идентификация белков и пептидов трипсин белок пептиды Расщепление в геле приготовление образца PMF

• 
  Слайд 17
  

  Идентификация пептидов:«пептидныйфингерпринт» (PFM)

• 
  Слайд 18
  

  «PerfinityiDP» – автоматизированная подготовка белковых образцов для анализа

  Обычно подготовка проб для протеомного анализа требует 18-часового гидролиза трипсином PerfinityiDP cнижает время пробоподготоки до 30 мин! Система обеспечивает автоматическую замену буфера, ферментное разложение, обессоливание и ОФ разделение Уменьшение вспомогательного оборудования, минимизация ошибки, увеличение продуктивности лаборатории Применение: очистка белков, разработка лекарственных препаратов, исследование биомаркеров Колонка с иммобилизованным трипсином

• 
  Слайд 19
  

  «PerfinityiDP» – автоматизированная подготовка белковых образцов для анализа УФ-хроматограмматрипсиновогогидролизатаIgG МС-хроматограмматрипсиновогогидролизататрансферина

• 
  Слайд 20
  

  Результаты 6 последовательных анализов трипсиновогогидролизататрансферина Полная автоматизация процесса пробоподготовки обеспечивает получение надежных и воспроизводимых результатов «PerfinityiDP» – автоматизированная подготовка белковых образцов для анализа

• 
  Слайд 21
  

  Смесь белков 1D гель-электрофорез Гидролиз в геле ОФ хроматография Гидролизв растворе SCX хроматография Обессоливание и перенос Поиск по базам данных Идентификация белка MS анализ ОФ хроматография MS анализ Совмещение MALDI-МСи ВЭЖХ

• 
  Слайд 22
  

  AccuSpot – нано-споттер для MALDI-MС

• 
  Слайд 23
  

  Элюат Раствор матрицы Промывка Газ-осушитель Образец Оптический датчик Мишень acetone & gas line matrix line sample line AccuSpot – нано-споттер для MALDI-MС

• 
  Слайд 24
  

  ВЭЖХ-MALDI Time  Хроматограммаа УФ Образец: ферментный гидролизат или смесь нативных белков ВЭЖХ разделение 1D или 2D MALDI-MS Автоматическое совместное нанесение элюента и матрицы на мишень AccuSpot

• 
  Слайд 25
  

  1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 Mass/Charge 1853.99 1502.66 1606.85 1983.08 2111.16 1856.96 1609.63 1564.62 1917.92 1986.07 2046.00 1271.71 1271.67 877.06 941.43 2174.08 917.27 1662.85 1326.53 927.39 1399.88 5 mins 7 mins 6 mins 5.5 mins 6.5 mins ВЭЖХ-MALDI 50 фМ гидролизата миоглобина

• 
  Слайд 26
  

  Новое интесивно развивающееся направление: идентификация микроорганизмовметодом масс-спектрометрии MALDI

  Идентификация Идентификация микроорганизмов: Быстрый и надежный скрининг широкого спектра микроорганизмов Идентификация грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, водорослей, грибов и дрожжей Надежная идентификация возможна благодаря тому, что MALDI является таксономически-специфичным Для идентификации используются масс-спектры из базы данных SARAMIS SARAMIS: Spectral ARchiveAnd Microbial Identification System Неизвестный микроорганизм

• 
  Слайд 27
  

  Принцип идентификации: рибосомальные белки

• 
  Слайд 28
  

  28 Масс-спектры нативных бактериальных клеток: масс-спектрометрические «отпечатки пальцев»

• 
  Слайд 29

  SARAMIS

  Референсные масс-спектры Изолят Культура Единичный спектр = Референсный спектр MALDI-TOF анализ СуперСпектры

• 
  Слайд 30

  Система AXIMA iDplus для идентификации

  Образец Перенос на MALDI подложку Экспорт данных в SARAMIS LIMS Идентификация/Обработка результатов Матрица Извлечение белков

• 
  Слайд 31
  

  iDPlus: подготовка образца к анализу Приготовление образцов бактерий, дрожжей, водорослей и грибков прямым методом «мазка». Никакая дополнительная пробоподготовка не требуется (даже для дрожжей).

• 
  Слайд 32

  iDPlus: идентификация с помощью MALDI и SARAMIS

  Получение масс-спектра Экспорт в SARAMIS (ASCII) Имя файла Имя образца Уровень совпадения Дата/время Семейство Род Вид К-во масс-пиков 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z Результаты

• 
  Слайд 33
  

  Сравнение полученных спектров с эталонными спектрами (в библиотеке ~ 400 родов, 1400 видов) семейство род вид Библиотека позволяет проводить последовательную идентификацию, основываясь на пиках характериных для семейства, рода и, наконец, вида Поиск в библиотеке SARAMIS

• 
  Слайд 34
  

  MALDI Imaging Mass Spectrometry позволяет визуализировать пространственное распределение молекул в биологических образцах, например, в гистологических срезах тканей Лазер Срез ткани　　 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Ионизированные биомолекулы　　 Матрица ＋ Технология молекулярной визуализации методом масс-спектрометрии MALDI MADI-TOF масс-спектрометрия iMScope

• 
  Слайд 35
  

  Визуализирующаямасс-спектрометрия – мощная технология для молекулярной визуализации

  Визуализация распределения биомолекул в различных гистологических образцах Свежевыделенные, замороженные, зафиксированные в формалине и залитые парафином (FFPE), клеточные культуры Идентификация широкого спектра высоко- и низкомолекулярных соединений Липиды (фосфолипиды: PC,PE,SM,SE и др.), белки/пептиды, низкомолекулярные метаболиты (АТФ/АДФ/АМФ и др), лекарства и их метаболиты и т.д. Высокоточная идентификация за счет МС/МС анализа Одновременная визуализация многих молекул Нет необходимости в предварительном выборе соединения Непрерывный анализ: скрининг и идентификация Детектирование без меток или мишеней Не нужны изотопные или флуоресцентные метки (соответственно сигнал не «размывается» в пространстве) Нет необходимости использовать антитела

• 
  Слайд 36

  Приборы для молекулярной визуализации

• 
  Слайд 37

  Концепция iMScopeTRIO

  Прямая идентификация молекул в тканях с помощью масс-спектрометрии после получения оптического изображения исследуемой ткани 1. Сравнение с микроскопом 2. Анализ биологических образцов 3. Высокое пространственное разрешение 4. Скоростной анализ 5. Возможность идентификации 6. Простота 7. Воспроизводимость Список пожеланий(Hamamatsu Univ. and Keio Univ.) 37 Молекулярное распределение Оптическое изображение Fusion Распределение квертицина Как распределены молекулы? Масс-спектр Идентификация молекул MСизображение Оптическое изображение

• 
  Слайд 38
  

  Система молекулярной визуализации«iMScopeTRIO» Особенности Высочайшее пространственное разрешение Встроенная оптическая и масс- визуализация МАЛДИ при атмосферном давлении Структурный анализ в режиме MSn Высокоскоростная обработка данных CDL Микро-скоп образец Оптическое изображение Take Photo Сбор данных Ионизация (MALDI) Блок масс-спектрометра (LCMS-IT-TOF Блок МАЛДИ микроскопа 2014 Август

• 
  Слайд 39

  Обеспечивает оптически прозрачный слой матрицы

  Характеристики: Мелкозернистая структура слоя матрицы Контроль толщины слоя матрицы улучшает воспроизводимость результатов Автоматизированная пробоподготовка Осаждение из паровой фазы дает более четкие изображения, чем при распылении, и позволяет визуализировать пограничные области на срезах тканей. (См. место, отмеченное стрелками). iMLayer: Система осаждения матрицы из паровой фазы m/z　772.52　 PC (16.0/16.0) + K Распыление 500 мкм Оптическое изображение Вакуумное осаждение

• 
  Слайд 40
  

  Интегрированная система молекулярной визуализации (программное обеспечение) Инструменты статистического анализа Специализированное программное обеспечение для iMScope «Imaging MS Solution»для сбора и анализа данных Регистрация пиков Стат.анализ Кластерный анализ (HCA) Анализ основных компонентов(PCA) Анализ интересующих зон(ROI) 　　Построение 　　масс-спектра Интуитивно понятное программное обеспечение Fig. 1 Data Analysis Software PCA　　　　　　　　　　　　　　　　　HCA　　　　　　　　　　　　　　　ROI Автоматический анализ сокращает время поиска целевых компонентов Быстрый поиск целевых соединений и построение пространственного распределения

• 
  Слайд 41
  

  41 iMScopeTRIO Интегрированное оптическое изображение Функция совмещения оптического и МС- изображений Совмещение оптического и МС- изображений распределения кверцетина в печени мыши Молекулы лекарственного средства были идентифицированы в непосредственно в тканях Наложение m/z 269,2→224,97 MС/MСизображения （50 х 50 мкм） m/z 269,2→224,97 MС/MСизображение　（5 х 5 мкм） Увеличенное совмещенное изображение m/z 269.2→224.97MС/MСизображение （25 х 25 мкм） «Imaging MS Solution» Обеспечивает расширенные возможности анализа изображений

• 
  Слайд 42
  

  42 Kubo et al., Anal. And Bioanal. Chem 2011 Пригоден для исследований рака (в том числе патологических) или при разработке и оценке противоопухолевых препаратов Принцип: Предыдущий метод: Иммуноокрашивание не позволяет отличить восстановленную и окисленную форму глутатиона. iMScope: Распределение восстановленной и окисленной форм глутатиона можно визуализировать. Масштаб: 0,5 мм d: Пониженное содержание глутатиона Больше в области толстой кишки и меньше внутри опухоли. e: Окисленный глутатион c: UDP-GlcNAc накапливается в опухолевой ткани. f: Мольное соотношение окисленной и восстановленной форм глутатиона. Отношение восстановленной формы глутатиона выше в опухолевой ткани. a, b: Изображения со встроенного оптического микроскопа Клеточные линии пересаженного рака толстой кишки имеют зеленую флуоресценцию. Раковые ткани с флуоресцентными метками можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа. [GSH] app / [GSSG] app 0 5 [GSH] app m mol/ g tissue 0 15 [GSSG] app m mol/ g tissue 0 10 [UDP-HexNAc] app m mol/ g tissue 0 1.0 Изображение светового микроскопа Изображение флуоресцентного микроскопа Зеленое: Опухоль b a c e d f iMScopeTRIO Возможности визуализации с использованием флуоресцентной микроскопии МС визуализация рака толстой кишки человека, пересаженного в печень мыши

• 
  Слайд 43
  

  ■　Переключение между режимами ESI и MALDI 43 Новая функцияiMScopeTRIO: Возможность ионизации электроспреем (ESI) в режиме работы ВЭЖХ-МС Working: Door close Visualizing ESI condition on PC Подключение блока ESI  Увеличение чувствительности и точности структурного анализа за счет MСn(n≦10 ) и предварительной сепарации при помощи ВЭЖХ iMScopeTRIO Качественный и количественный анализ DL ESI

• 
  Слайд 44
  

  44 Приложение(Высокое пространственное разрешение) Моделирование пространственного разрешения, позволяющего визуализировать пигментный слой сетчатки Для визуализации пигментного слоя сетчатки требуется пространственное разрешение в 10 мкм или лучше. Наложение Черный: Эпителий пигметного слоя сетчатки Синий: ФХ (16:0/22:6) Зеленый: ФХ (18:0/22:6) Красный: ФХ (16:0/18:1) Используется для наблюдения за распределением лекарственных средств в микрообласти или локализованных скоплений метаболитов. Принцип: В дополнение к трехслойному распределению ФХ отображается тонкий черный слой эпителия. ОМ фотография сетчатки Эпителий пигментного слоя сетчатки (макс. ширина 10 мкм) Pixels: 50  50 Spatial resolution: 10 m Measurement time: About 7 min Внешняя сетчатка Внутренняя сетчатка 0% 100 % m/z 798.54 Липид ФХ (16:0/18:1) + K Наложенное: Красное m/z 872.61 Липид ФХ (18:0/22:6) + K Наложенное: Зеленое Разрешение: 10 мкм Оптическое изображение Разрешение: 20 мкм (Пигментный слой нечеткий) Разрешение: 50 мкм (Пигментный слой нечеткий) Разрешение: 100 мкм (Пигментный слой нечеткий) ФХ: фосфатидилхолин Внешняя сетчатка Внутренняя сетчатка Внешняя сетчатка Внутренняя сетчатка

• 
  Слайд 45
  

  Образец：срез ткани мозга Матрица：DHB（Sublimation） Размер пикселя：10 мкм Размер：250×250 Оптическое изображение m/z 769.5 m/z 772.5 m/z 798.5 ２００μm m/z 848.6 Сфингомиелин Фосфатидилхолин Фосфатидилхолин Галактозилцерамид Визуализация MALDI: анализ распределения фосфолипидов в сетчатке

• 
  Слайд 46
  

  m/z intensity m/z intensity Масс-пики специфичные для здоровой ткани Масс-пики специфичные для опухолевой ткани Здоровая ткань Опухоль Масс-спектры каждой области Оптическое изображение Матрица: CHCA МS изображение, m/z 616 Образец: срез ткани Визуализация MALDI: : применение в клинических исследованиях

• 
  Слайд 47
  

  15 мин после ввода МС изображение Таксола Контрольный препарат m/z 834.56 Раковая клетка 0% 100% Визуализация воздействия таксола на раковые клетки Таксол Визуализация MALDI: применение в клинических исследованиях 1 час после ввода 24 часа после ввода

• 
  Слайд 48
  

  Условия Матрица: 50 мг/млDHB (70% MeOH/0.1% TFA)1 мл Срез: 10 мкм Шаг сканирования: 200 мкм Прибор: Mass-microscope Масс-изображение было получено после 30 минут с момента внутривенного введения фамотидина (m/z 338.05） Было обнаружено специфическое накапливание фамотидина в почках Фармакокинетика фамотидина 肺 肝臓 腎臓 脳 脊椎 5 mm 心臓 腸 C D 胃 E High High Low Low Famotidine m/z 338.05 Cont. m/z 338.05 Section Срез тушки мыши Визуализация MALDI: применение в фармацевтических исследованиях

• 
  Слайд 49
  

  Большое спасибо!