Презентация на тему "Титова Татьяна НиколаевнаКафедра лабораторной диагностики ИПО БГМУ Уфа-2013"

Содержание

• 
  Слайд 1
  

  Титова Татьяна НиколаевнаКафедра лабораторной диагностики ИПО БГМУ Уфа-2013

  ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

• 
  Слайд 2
  

  Реакции антиген-антитело - основа диагностических реакций. Фазы реакции: специфическая фаза - быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. неспецифическая фаза - более медленная, проявляется видимыми физическими явлениями (образование хлопьев, помутнения); требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды). Прочность и количество связавшегося антигена зависят от свойств антител: аффинности, валентности, авидности.

• 
  Слайд 3
  

  Серологические методы (от лат. serum — сыворотка и logos — учение) – методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген-антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. ЦЕЛИ: постановка диагноза (обнаружение в сыворотке больного антител против антигенов возбудителя); идентификация антигенов микробов, биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.(с помощью диагностических сывороток).

• 
  Слайд 4
  

  Виды серологических реакций: агглютинации, преципитации, нейтрализации, р-ии с участием комплемента, р-ии с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Различаются по регистрируемому эффекту, технике постановки. Характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.

• 
  Слайд 5
  

  Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio - склеивание) реакция связывания антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, макромолекулярных агрегатов). Протекает при наличии электролита (изотонического раствора NaCl) Проявляется образованием хлопьев или осадка. Применение: 1) определение антител в сыворотке крови больных (при бруцеллезе - реакции Райта, Хеддельсона, при брюшном тифе и паратифах -реакция Видаля и т.д.); 2) определения возбудителя, выделенного от больного; 3) определения групп крови с исп-ем моноклональных антител.

• 
  Слайд 6
  

  Схема реакции агглютинации ,

• 
  Слайд 7
  

  Ориентировочная реакция агглютинации Определение (серотипирование) возбудителя, выделенного от больного. На предметном стекле: капля диагностической агглютинирующей сыворотки (антитела) в разведении 1:10 или 1:20 + чистая культура возбудителя, выделенного от больного. Контроль: вместо сыворотки - каплю раствора натрия хлорида. При появлении хлопьевидного осадка ставятразвернутую реакцию агглютинации

• 
  Слайд 8
  

  Развернутая реакция агглютинации Определение (серотипирование) возбудителя, выделенного от больного. Разведения агглютинирующей сыворотки + 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакция положительная, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Контроли: сыворотка + р-рNaCl - должна быть прозрачной, взвесь микробов + р-рNaCl - равномерно мутной, без осадка.

• 
  Слайд 9
  

  Развернутая реакция агглютинации. Определение у больного антител. Разведения сыворотки крови больного + Диагностикум (взвесь убитых микробов) инкубация при 37 °С Отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация (осадок). Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител: 0-диагностикум (бактерии, убитые нагреванием, =>0-антиген) - мелкозернистая агглютинация. Н-диагностикум (бактерии, убитые формалином, =>Н-антиген) - крупнохлопчатая агглютинация, протекает быстрее.

• 
  Слайд 10
  

  Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) Определение у больного антител. Сыворотка больного + Антигенный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на них антигенами). Результат: склеивание и выпадение эритроцитов на дно ячейки в виде фестончатого осадка. Отрицательная реакция: эритроциты оседают в виде «пуговки». Реакция обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА) Например, обнаружение ботулинического токсина (+эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум). Применение РНГА: диагностика инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче (беременность), выявление повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и др.

• 
  Слайд 11
  
• 
  Слайд 12
  

  Реакция коагглютинации. Принцип: стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. Стафилококки + Иммунная диагностическая сыворотка(предварительно) + Микробы, выделенные от больных (антигены) Результ: хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

• 
  Слайд 13
  

  Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) Принцип: блокирование антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. Применение: диагностика многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных. Вирусы Эритроциты Антивирусные АТ Нейтрализация вирусов животного

• 
  Слайд 14
  

  Реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса) Обнаружение неполных антител. Они специфически взаимодействуют с резусположительными эритроцитами (антигены), но не вызывают их агглютинации. антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты + антиглобулиновая сыворотка (антитела против иммуноглобулинов человека) Результат: агглютинация эритроцитов. Применение: диагностика патологических состояний, связанных с внутрисосудистым лизисом эритроцитов (ГБН: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери).

• 
  Слайд 15
  

  Схема реакции Кумбса

• 
  Слайд 16
  

  Реакция преципитации(от лат. praecipito - осаждать) - формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения (преципитата). Образуется при смешивании АГ и АТ в эквивалентных количествах (избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса). Варианты постановки: в пробирках, в гелях, в питательных средах и др.

• 
  Слайд 17
  

  Реакция кольцепреципитации. Проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. Результат: образуется непрозрачное кольцо преципитата Реакция Асколи (при сибирской язве) В качестве антигенов - прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей.

• 
  Слайд 18
  

  Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Постановка: 1. растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку 2. после затвердевания в геле вырезают лунки (2-3 мм). 3. в лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. Результат: в месте встречи образуется преципитат в виде белой полосы. (у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентичных – пересекаются). Применяется для обнаружения дифтерийной палочки.

• 
  Слайд 19
  

  Реакция радиальной иммунодиффузии. Постановка: 1. иммунная сыворотка + расплавленный агаровый гель равномерно наливают на стекло. 2. после застывания делают лунки 3. в лунки помещают антиген. Результат: образование кольцевых зон преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца пропорционален концентрации антигена. Используется для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

• 
  Слайд 20
  

  Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини 100 50 25 12.5

• 
  Слайд 21
  

  Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини

• 
  Слайд 22
  

  Реакции с участием комплемента - основаны на активации комплемента комплексом АГ-АТ.

• 
  Слайд 23
  

  Реакция связывания комплемента (РСК) Принцип: АГ-АТ(Fc-фрагмент) + Комплемент = связывание Комплемента. Постановка в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента; добавляем гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолиткческая сыворотка с антителами к ним).

• 
  Слайд 24
  

  Оценка результатов: реакция отрицательная – свободный комплемент + комплекс эритроцит - антиэритроцитарное антитело =гемолиз;. реакция положительная - связанный комплемент не вызывает гемолиза. Применение РСК - диагностика инфекционных болезней (сифилис - реакция Вассермана, гонококки – реакция Борде-Жанга)

• 
  Слайд 25
  

  Реакции иммунного лизиса Принцип: АТ-АГ + комплемент = лизис клеток (активация системы комплемента по классическому пути). Разновидности: реакция гемолиза реакция бактериолиза

• 
  Слайд 26
  

  Реакция радиального гемолиза (РРГ) Постановка: 1. гель из агара + эритроциты барана (с адсорбированными антигенами вируса) + комплемент 2. делаем лунки 3. вносим в лунку сыворотку больного (АТ против вируса) Результат: вокруг лунки образуется зона гемолиза. Определяем антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом.

• 
  Слайд 27
  

  Реакция бактериолиза Принцип: антитела-лизины в присутствии комплемента способны растворять микробы и другие клеточные элементы. Постановка:сыворотку б-го разводим бульоном + взвесь живых холерных вибрионов Результат: бульон прозрачный (произошел лизис микробов) Применяется для диагностики холеры.

• 
  Слайд 28

  Реакции с использованием меченых антител или антигенов

• 
  Слайд 29
  

  Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Основные разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

• 
  Слайд 30
  

  Прямой метод РИФ Принцип: АГ + АТ (меченные флюорохромами) = АГ-АТ светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Результат: бактерии в мазке светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

• 
  Слайд 31
  

  Непрямой метод РИФ Принцип: выявление АГ-АТ с помощью антиглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромом. Постановка: мазок из взвеси микробов + диагностическая сыворотка (антитела) антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают АГ-АТ + антиглобулиновая (против АТ) сыворотка, меченная флюорохромами Результат: образуется комплекс АГ-АТ-антиАТ(флюорохром), который наблюдают в люминесцентном микроскопе. Преимущества: можно применять разные диагностические сыворотки.

• 
  Слайд 32
  

  Прямой метод Непрямой метод

• 
  Слайд 33

  Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)Препарат риккетсий

• 
  Слайд 34

  Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)T.pallidum

• 
  Слайд 35
  

  Иммуноферментный анализ (ИФА) Принцип: выявление АГ с помощью АТ+фермент-метка (пероксидаза хрена, бета-галактозидаза или щелочная фосфатаза). АГ-АТ-фермент + Хромоген ->изменение цвета продукта реакции Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

• 
  Слайд 36
  

  Иммуноферментный анализ (ИФА) Применение: диагностика вирусных, бактериальных и паразитарных болезней (ВИЧ-инфекций, гепатита В и др.), определени гормонов, ферментов, лекарственных препаратов, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях.

• 
  Слайд 37
  

  Твердофазный ИФА Принцип: один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе (в лунках планшеток из полистирола). Постановка: в лунки планшеток с сорбированным антигеном + сыворотка больного + антиглобулиновая сыворотка (меченная ферментом) + хромоген. После добавления очередного компонента - тщательная промывка (удаление несвязавшихся реагентов) Результат: изменение цвета раствора хромогена.

• 
  Слайд 38
  

  Конкурентный вариант ИФА Принцип: искомый АГ и меченный ферментом АГ конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки, искомые АТ и меченые АТ конкурируют друг с другом за антигены. Интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

• 
  Слайд 39

  Твердофазный ИФА (конкурентный и неконкурентный)

• 
  Слайд 40
  

  Радиоиммунологический анализ (РИА) Принцип: применение антигенов или антител, меченных радионуклидом. Образуется радиоактивный ИК. Его радиоактивность определяют в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул АГ и АТ. Модификации: твердофозный РИА конкурентный РИА. Метод представляет определенную экологическую опасность.

• 
  Слайд 41
  

  Иммуноблоттинг (от англ. blot, пятно) сочетание электрофореза и ИФА или РИА. Высокочувствительный метод Принцип. Антиген выделяют с помощью электрофореза и переносят его на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Постановка: полоски с «блотами» антигенов + сыворотка больного + антииммуноглобулиновая сыворотка (фермент) + хромоген Результат: изменение окраски хромогена под действием фермента Используется как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

• 
  Слайд 42
  

  СПАСИБО за ВНИМАНИЕ!