Презентация на тему "Электрофорез ДНК в агарозном геле"

Содержание

• 
  Слайд 1
  

  Электрофорез ДНК в агарозном геле

• 
  Слайд 2
  

  Электрофорез ДНК в агарозном геле Катод? Анод?

• 
  Слайд 3
  

  Электрофорез ДНК в агарозном геле Катод? Анод? анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс

• 
  Слайд 4
  

  Электрофорез ДНК в агарозном геле Катод? Анод? анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс Куда движется ДНК? Как она заряжена?

• 
  Слайд 5
  

  Электрофорез ДНК в агарозном геле Катод? Анод? анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс Куда движется ДНК? Как она заряжена? Благодаря заряду фосфатных групп, ДНК имеет отрицательный заряд.

• 
  Слайд 6
  

  Электрофорез ДНК в агарозном геле Катод? Анод? анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс Куда движется ДНК? Как она заряжена? Благодаря заряду фосфатных групп, ДНК имеет отрицательный заряд. Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») — направленное движение коллоидных частиц или ионов под действием электрического тока

• 
  Слайд 7
  

  Вольтаж Источник тока Сила тока – А Напряжение – V Сопротивление – R закон Ома:

• 
  Слайд 8
  
• 
  Слайд 9
  

  Буферные растворы

• 
  Слайд 10
  
• 
  Слайд 11
  

  РЕСТРИКЦИОННЫЕ КАРТЫ 5’ 5’ 3’ 3’ EcoR EcoR 600bp

• 
  Слайд 12
  

  РЕСТРИКЦИОННЫЕ КАРТЫ 5’ 5’ 3’ 3’ EcoR EcoR 600bp BamH1 NcoI 200bp

• 
  Слайд 13
  

  3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250 Результат ПЦР от 03.12.13 П.Н. Амплифицировали кДНК одноцепочечного антитела при помощи ПЦР (одноцепочечное антитело состоит из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей) Длина ожидаемого фрагмента 700 пн ?

• 
  Слайд 14
  

  План работ Получение (выделение) нужного нам гена Линеаризация вектора Лигирование (встраивание) гена в вектор Приготовление компетентных клеток Электропорация (внедрение) вектора с нашим геном в компетентные клетки Синтез и выделение белка

• 
  Слайд 15
  
• 
  Слайд 16
  

  Лаборатория биотехнологии ФГБУН Институт экологии человека Сибирского отделения Российской академии наук 2014 Кемерово

• 
  Слайд 17
  

  План работ Выделение и очистка ДНК Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка ПЦР ферментативное копирование фрагмента ДНК Вектор для наработки ДНК

• 
  Слайд 18
  
• 
  Слайд 19
  

  lg m=lg m0 - Krt

• 
  Слайд 20
  

  Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК и вида буфера

• 
  Слайд 21
  

  План работ Выделение и очистка ДНК Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка ПЦР ферментативное копирование фрагмента ДНК Вектор для наработки ДНК

• 
  Слайд 22
  

  План работ Вектор для экспрессии белка Линеаризация вектора разрезание рестриктазами Сшивании вектора с геном реакция лигирования Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

• 
  Слайд 23
  

  План работ Трансфекция введения ДНК в бактериальную клетку Методом электропорации Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

• 
  Слайд 24
  

  План работ Экспрессия белка Создание условий для наработки белка Выделение и очистка белка Готовый белковый продукт Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

• 
  Слайд 25
  

  21 октября Измерение концентрации ДНК ПЦР Форез 10:00-11:00 – лекция 11:00-13:00 – определение концентрациивыделенной ДНК 13:00-13:30 – обед 13:30-14:00– ПЦР 14:00-15:00 – лекция 15:00-16:00 – форез

• 
  Слайд 26
  

  Спектрофотометрия препаратов днк, рнк и белков С помощью спектрофотометра можно точно и быстро определить концентрацию ДНК, а также степень ее чистоты. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. А для оценки чистоты препарата ДНК, проводят измерения оптической плотности раствора еще и при 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов белков и полисахаридов, соответственно. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК должно быть больше 1,8, значение А260/235 должно быть больше, чем 2,2. Одна (каждая) оптическая единица соответствует концентрации: dsDNA (двуцепочечная ДНК) в 50 мкг/мл ssDNA (одноцепочечная ДНК) в 37 мкг/мл ssRNA (одноцепочечнаяРНК) в 40 мкг/мл Нижний предел концентрации ДНК, которую можно определить спектрофотометрически, составляет 0,1 мкг/мл. Спектрофотометрия – физико-химический метод исследования растворов и твердых веществ, основанный на изучении поглощения в различных областях спектра.

• 
  Слайд 27
  

  Все о электрофорезе ДНК в агарозном геле

• 
  Слайд 28
  

  Электрофорез ДНК в агарозном геле Отрицательно заряженный электрод Куда движется ДНК? Благодаря суммарному заряду всех фосфатных групп, ДНК имеет большой отрицательный заряд. Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») — направленное движение коллоидных частиц или ионов в жидкой среде под действием электрического поля Анод Катод Положительно заряженный электрод ????? азотистое основание пентоза Фосфатная группа Как она заряжена? В протонной теории кислот и оснований Брёнстеда — Лоури, кислотой называется соединение или ион, способное отдавать протон другому химическому соединению — основанию. Впервые это явление было открыто профессорами Московского университета П.А. Страховым и Ф.Ф. Рейссом в 1809 году.

• 
  Слайд 29
  

  Электрофорез Электрофорез в агарозном геле является стандартным методом для разделения, идентификации и очистки молекул ДНК и их фрагментов

• 
  Слайд 30
  

  Электрофорез Электроды Подложка для геля Агарозный гель Буферный раствор Камера для проведения горизонтального фореза (гель должен быть закрыт слоем буфера толщиной 1 мм) Всегда помните, что ДНК бежит от «-» к «+», от черного электрода к красному

• 
  Слайд 31
  

  гель должен быть закрыт слоем буфера в 1мм Электрофорез Электроды Подложка для геля Агарозный гель Буферный раствор Камера для проведения горизонтального фореза

• 
  Слайд 32
  

  Скорость миграции ДНК через поры агарозного геля называется электрофоретической подвижностью и определяется несколькими параметрами Электрофорез

• 
  Слайд 33
  

  Размер молекул ДНК Конформация ДНК Чем больше размер, тем меньше электрофоретическая подвижность, крупные молекулы движутся медленнее из-за большего сопротивления Скорость обратно пропорциональна десятичному логарифму молекулярной массы (Mw) ДНК   линейная–форма III кольцевая неповрежденная – форма I кольцевая с одноцепочечным разрывом –форма II

• 
  Слайд 34
  

  Состав оснований и температура В области температур 4 – 30 °С изменения подвижности ДНК не наблюдаются Электрофоретическая подвижность в агарозном геле практически не зависит от состава оснований Напряженность электрического поля Напряженность ЭП для электрофореза обычно составляет 1 – 8 В/см наилучшее разделение при 5 В/см Это сила, действующая на точечный заряд, помещенный в данную точку поля При более высокой напряженности могут изогнуться полосы ДНК или расплавится небольшие фрагменты ДНК Единицы измерения: В/см

• 
  Слайд 35
  

  Изменяемые параметры Источник тока Напряжение – U (Volt) или Сила тока – I (Amper) Закон Ома:I = U / R  V=A x R  A=V / R Могут работают в двух режимах: Постоянное напряжение Постоянная сила тока Напряженность электрического поля

• 
  Слайд 36
  

  β-D-галактопираноза 3,6-ангидридо-α-1-галактопираноза Агароза — линейный полисахарид, получаемый из агара, образованный из чередующихся остатков β-D-галактопиранозы и 3,6-ангидридо-α-1-галактопиранозы, объединённых 1→4 связью. Обладает ярко выраженным свойством к формированию гелей. Точка плавления ≈ 95 °C Точка образования геля ≈ 45 °C Гель является термообратимым Концентрация агарозы

• 
  Слайд 37
  

  Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК Зная размеры молекул ДНК в смеси, можно подбором концентрации добиться их наилучшего разделения Манипуляция с агарозой менее 1% только при +60С!!!!

• 
  Слайд 38
  

  Типы агароз Легкоплавкая агароза: плавится при 600С. Форез ведут при +60С.

• 
  Слайд 39
  

  Маркеры Представляет собой смесь ДНК фрагментов известной длины (молекулярного веса) пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в электрофорезе. 1kb 100bp +15kb +3kb 50kb ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности окрашивания фрагментов одинаковой длины.

• 
  Слайд 40
  

  3,8-диамино-5-этил-6-фенил-фенантридиум бромид Окраска ДНК в агарозных гелях Для визуализации ДНК применяют флюоресцирующий интеркалирующий краситель – бромистый этидий (EtBr) Молекулы красителя интеркалируют (встраиваются) между соседними парами нуклеотидов ДНК. Максимум поглощения EtBr наблюдается при длинах волн 300 и 360 нм (УФ-излучение), а эмиссия происходит в красно-оранжевой области видимого спектра при 590 нм

• 
  Слайд 41
  

  Окраска бромистым этидием (EtBr) При связывании с ДНК интенсивность флюоресценции EtBr увеличивается в 20 раз и обеспечивает высокую чувствительность: от 10 нг ДНК Интенсивность свечения зависит от размера ДНК: чем длиннее молекула, тем интенсивнее окраска. Бромистый этидий сильный канцероген, поэтому все операции с ним следует проводить в перчатках!!!!!!!!!!!!!!!

• 
  Слайд 42
  

  Два способа окрашивания бромистым этидием: Сразу добавлять в расплавленную агарозу. – EtBrзаряжен положительно, мигрирует к катоду – тем самым несколько замедляя продвижение ДНК – необходимость добавления и в электродный буфер – больше «грязи» +лучше разрешение + в целом, электрофорез проходит быстрее Гель окрашивают после электрофореза в растворе содержащим EtBr. – дольше, так как часто требуется еще и отмывка от этидия – хуже разрешение + менеше«грязи» – менее ядовито  Рабочая концентрация бромистого этидия – 0,1-0.5 мкг/мл Везде одинаковая и в геле и в буфере и в красящем растворе Обычно готовят стандартный (стоковый) 20000x кратный раствор 1 г EtBr разводят в 100 мл дистиллированной воды. Стоковая концентрация 10 мг/мл. Окраска бромистым этидием (EtBr) EtBr добавлен в гель Окрашивание EtBr после фореза

• 
  Слайд 43
  

  Буфер для образцов 1. “Утежелитель” – в увеличивает плотность раствора, для того чтобы образцы сразу опускаются на дно лунки Состав буфер для образцов: 10x кратный стоковый раствор 50% глицерин или 70% сахарозаили 25% фикол 0.25% бромфеноловый синий и/или 0.25% ксиленцианол 1x TAE буфер Рабочая концентрация “утежелителя”: - глицерин: 6-10 % - сахароза: 6-7 % - фикол: 2,5 %

• 
  Слайд 44
  

  * облегчает внесение образцов в лунку; *Заряжен “–”, движется в том же направлении, что и ДНК * позволяет иметь представление, на каком этапе сейчас электрофорез; * может мешать наблюдению фрагментов под UV; * может оказаться нежелательной примесью при элюции фрагмента из геля. Буфер для образцов Состав буфер для образцов: 10x кратный стоковый раствор 50% глицерин и/или 70% сахароза и/или 25% фикол 0.25% бромфеноловый синий и/или 0.25% ксиленцианол 1x TAE буфер 2. Краситель

• 
  Слайд 45
  

  бромфеноловый синий ксилен цианол Буфер для образцов Красители тоже имеют различную электрофоретическую подвижность

• 
  Слайд 46
  

  бром феноловый синий ксилен цианол Буфер для образцов Красители тоже имеют различную электрофоретическую подвижность

• 
  Слайд 47
  

  лигирование TBE: 1x Трис-борат-ЭДТА (TBE) 89 мМТрис (рН 7,6), 89 мМ борной кислоты, 2 мМ ЭДТА 5x стоковый (1 литр) - растворить в 600 мл дистиллированной воды: 54 г Трис основной (FW = 121) 27,5 г борной кислоты (FW = 61,8) 20 мл 0,5 М EDTA (рН 8,0) Довести до конечного объема 1 л дистиллированной водой. Минусы: Хуже разрешение Невозможно дальше выделять и использовать образцы Электродный буферный раствор TAE: 1x Трис-ацетат-ЭДТА 40 мМ Трис (рН 7,6), 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА 50x стоковый (1 литр) - растворить в 600 мл дистиллированной воды: 242 г Трис основной (FW = 121) 57,1 мл ледяной уксусной кислоты 100 мл 0,5 М EDTA (рН 8,0). Довести до конечного объема 1 л дистиллированной водой.

• 
  Слайд 48
  

  лигирование Минусы: Хуже разрешение Низкая буферная емкость – при длительных эл.форезах происходит истощение буфера Невозможно дальше выделять и использовать образцы, т.к. борная кислота ингибирует многие ферментативные реакции TAE: TBE: Исторически сложилось так, что TAE используют чаще других буферных р-рв Электродный буферный раствор

• 
  Слайд 49
  

  Видео

• 
  Слайд 50
  

  Видео

• 
  Слайд 51
  

  Электрофорез ДНК в акриламиде

• 
  Слайд 52
  

  Капиллярный электрофорез В 1960х годах была предложена методика капиллярного электрофореза для разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом. Используется при секвенировании ДНК Детектирование разделившихся молекул при капиллярном электрофорезе осуществляется специальными устройствами  Буфер 2 Буфер 1 + Образец Капилляр с электролитом Детектор Основное отличие от классического элетрофореза: используется специальный электролит, а не гель

• 
  Слайд 53
  

  Все о рестриктазах

• 
  Слайд 54
  

  Видео

• 
  Слайд 55
  

  РЕСТРИКЦИЯ Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) Класс гидролаз,катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

• 
  Слайд 56
  

  Система рестрикции-модификации  ферментативная система бактерий, разрушающая попавшую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция — защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид. Для компонентов системы характерны два типа активности —метилтрансферазная (метилазная) и эндонуклеазная. За каждую из них могут отвечать как отдельные белки, так и один белок, сочетающий в себе обе функции. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием)

• 
  Слайд 57
  

  К 2007 году выделено более трех тысяч эндонуклеаз рестрикции Одной из первой открытой рестриктазой была HindII. В 1978 году Вернер Арбер, Даниел НатансиХамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «За обнаружение рестрикционных ферментов и их применение в молекулярной генетике».

• 
  Слайд 58
  

  Рестриктазы первого типа (ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удаленной областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК). Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого типа узнают палиндромальные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего (промежуточного) типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты. Классификация рестриктаз При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами.

• 
  Слайд 59
  

  В практической молекулярной биологии чаще всего используются рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой  палиндром. Палиндром Палиндром буквосочетание, слово или текст, одинаково читающееся в обоих направлениях. Иногда палиндромом неформально называют любой симметричный относительно своей середины набор символов. CTT AAG GAA TTC 5’ 5’ 3’ 3’ CTT AAG GAA TTC 5’ 5’ 3’ 3’

• 
  Слайд 60
  

  GAA TTC CTT AAG 5’ 3’ 3’ 5’ G A A T T C G A A T T C GAA TTC CTT AAG • 5’ 3’ 3’ 5’

• 
  Слайд 61
  

  • 3’ 5’ CTT AAG GAA TTC 5’ 5’ 3’ 3’

• 
  Слайд 62
  

  Палиндро́м (от греч. πάλιν — «назад, снова» и греч. δρóμος — «бег»), иногда также палиндромон, от гр. palindromos бегущий обратно) число (например, 404), слово (например, топот или ротор текст (например, а роза упала на лапу Азора) одинаково читающееся в обоих направлениях Отдельные палиндромические словосочетания и фразы известны с глубокой древности, когда им зачастую придавался магически-сакральный смысл

• 
  Слайд 63
  

  Яд, яд, дядя! И лежу. Ужели? Яд ем как мед я! Гори, печурка, - круче пирог! Тут хорош сыр, крыс шорох тут. Ох и тихо!  Примеры полиндромов Магический квадрат с фразой SATOR AREPO TENET OPERA ROTAS (лат. Сеятель Арепо с трудом держит колеса), читаемой во всех направлениях

• 
  Слайд 64
  

  "Застольная мелодия для двоих" - Моцарт Примеры полиндромов "Путь Мира" - Игнац Мошелес Музыкальные произведения:

• 
  Слайд 65
  

  Названия рестриктазам даются по следующему принципу: род микроорганизма обозначается первой прописной буквой EcoRI – Escherichia BamH I – Bacillus вид— двумя строчными EcoRI – coli BamH I – amyloliquefaciens иногда указывают штамм в виде заглавной буквы EcoRI – RY13 BamH I – H1 Римские цифры — это порядковый номер данной эндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данного микроорганизма EcoRI BamHI Например, HраI и НраII — соответственно первая и вторая рестрицирующиеэндонуклеазы II типа, выделенные из Haemophilusparainfluenzae.

• 
  Слайд 66
  

  Рестриктазы являются ферментами, активность которых зависит от состава реакционной смеси и температуры проведения реакции. Буферные растворы

• 
  Слайд 67
  

  Оптимальная температура различная, чаще всего 37 ° С, но бывают и исключения: Sma I +25° С Bcl I +50° С BsaB I +60° С Bsm I +65° С Инактивация Длительность работы: От 1 часа до 12 часов Усливия работы рестриктаз Длительность и температура тоже различные, но не ниже 65 ° С

• 
  Слайд 68
  

  Общий объем рестриктазы не более 1/10 объёма реакционной смеси глицирин, входящий в состав буфера для хранения фермента, может ингибировать реакцию Усливия работы рестриктаз За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С (оптимальной температуре для данного фермента рестрикции ) в 50 мкл реакционной смеси. Все рестриктазы — Mg2+-зависимы. Буферные растворы должны содержать этот ион.

• 
  Слайд 69
  

  Некоторые рестриктазы при работе в неоптимальных условиях могут менять свою специфичность. Это называется Star-активностью и отмечается звёздочкой (*). Star-активность * Например, EcoRI при повышении рН и уменьшении ионной силы буфера вместо последовательности 5’- G AATTC -3’ узнаёт последовательность 5’- N AATTN -3’.

• 
  Слайд 70
  

  Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, разрезающих эти последовательности в одинаковых местах. Классификации рестриктаз Изомеры Изошизомеры Гетерошизомеры (неошизомеры) Изокаудомеры Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами. Примеры:

• 
  Слайд 71
  

  Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Изошизомеры, таким образом, являются частным случаем гетерошизомеров Гетерошизомеры (неошизомеры) Sma I  GGG^CCC Примеры: Xma I G^GGCCC GGGCCC

• 
  Слайд 72
  

  Рестриктазы, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами Изокаудомеры Mbo I N*GATC N N CTAG*N BamH I G*GATC C C CTAG*G Примеры:

• 
  Слайд 73
  

  Тупые и липкие концы Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу. могут образовываться липкие концы с 5‘ – выступающими нуклеотидами (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции BamHI). и 3‘ – выступающие липкие концы, когда неспаренные нуклеотиды заканчиваются 3'-концом (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции AatII). Тупые концы образуются, в случае, когда разрезание ДНК происходит строго по оси симметрии узнаваемой последовательности (пример эндонуклеазы рестрикции с такой специфичность — EcoRV).

• 
  Слайд 74
  

  Тупые и липкие концы Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу. могут образовываться липкие концы с 5‘ – выступающими нуклеотидами (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции BamHI). и 3‘ – выступающие липкие концы, когда неспаренные нуклеотиды заканчиваются 3'-концом (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции AatII). Тупые концы образуются, в случае, когда разрезание ДНК происходит строго по оси симметрии узнаваемой последовательности (пример эндонуклеазы рестрикции с такой специфичность — EcoRV). GGA TCC

• 
  Слайд 75
  

  Крупно- и мелкощепящие рестриктазы.  Встречаемость тетра- и гексануклеотидов в ДНК. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. К мелкощепящим относятся рестриктазы Hpa II и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - EcoR I (из Escherichia coli) и Hind III. Cайт из четырех (тетра-) нуклеотидоввстречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а из шести (гекса-) нуклеотидов - через 4096 пар оснований. Большинство рестриктаз II-класса узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 п. о., отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой EcoR I. (G↑AATTC)

• 
  Слайд 76
  

  Единицы активности рестриктазы.  – это количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК в реакционной смеси 50 мкл при оптимальных условиях (обычно при 37о С) за час. Хранение Рестриктазы хранятся при -20о С в буфере с 50% глицерина.

• 
  Слайд 77
  

  РЕСТРИКЦИОННЫЕ КАРТЫ 5’ 5’ 3’ 3’ EcoR EcoR 600bp BamH1 NcoI 200bp NcoI 400bp BamH1

• 
  Слайд 78
  

  400bp XhoI HindIII 200bp 1200bp 200bp 200bp 200bp NotI NcoI 5’ 3’ Задача на составление рестрикционных карт

• 
  Слайд 79
  

  HindIII 200bp 300bp NcoI 5’ 3’ Задача на составление рестрикционных карт 600bp NcoI 400bp HindIII 500bp 400bp 200bp 200bp 200bp 300bp 300bp A B A B 1200bp M 100bp 200bp 300bp 400bp 500bp 600bp 700bp A+B 300bp 200bp

• 
  Слайд 80
  

  5’ 3’ 262bp 500bp PstI PstI 762bp Задача на составление рестрикционных карт

• 
  Слайд 81

  Спасибо за внимание