Презентация на тему "Основы биотехнологии и биомедицины"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Основы биотехнологии и биомедицины

  Лекция 2 Технологии рекомбинантных ДНК Экспрессия рекомбинантных генов

• 
  Слайд 2

  Что такое «генная инженерия»?

  Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем с использованием манипуляций генами на молекулярном уровнепутем конструирования рекомбинантных ДНК и РНК

• 
  Слайд 3
  

  «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов, а не новых концепций. Новые концепции объясняют известные явления по-новому. Новые методы открывают новые явления, которые необходимо объяснить.»Freeman J. Dyson

• 
  Слайд 4
  

  В. Гейзенберг:Профессионал это тот, кто знает основные ошибки в своей области и умеет их избегать

• 
  Слайд 5
  

  В классической генетике и селекции – отбор среди потомства по определенным признакам ограничен репродуктивной изоляцией В генной инженерии при получении трансгенных организмов такие ограничения действуют слабее Генная инженерия облегчает обмен генами между природными генетическими системами

• 
  Слайд 6
  

  Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма denovoпо чертежам, разработанным в лаборатории - «синтетическая биология» 2000г. - геном вируса гепатита С (9,6 kbp)

• 
  Слайд 7

  КрейгВентер – один из лидеров современной синтетической биологии

  John Craig Venter, born 1946 Разработал метод идентификации мРНК с использованием EST-маркеров (expressed sequence tags) 1998 Основал фирму Selera (секвенирование генома человека) 2010 Синтетический митохондр. (16.3 kb) геном мыши 2010 Синтетический геном (580-kb ) и синтетический штамм Mycoplasmamycoides 2014 Синтетическая хромосома дрожжей III (273 kb) S. cerevisiae Разработка и создание биологических модулей, биологических систем и биологических машин для решения прикладных задач

• 
  Слайд 8

  Клонирование – одно из ключевых понятий генной инженерии

• 
  Слайд 9

  Что такое «клонирование»?

  В генной инженерии: получение «клона»: препарата идентичных молекул ДНК или «идентичных» живых организмов В случае ДНК два пути решения задачи: Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Рекомбинантные молекулы ДНК

• 
  Слайд 10

  Для чего нужны клоны ДНК?

  Для удобства проведения исследований Работать с индивидуальными молекулами ДНК трудно, но возможно

• 
  Слайд 11

  КлонированиеДНК

  Цель – получение клона идентичных последовательностей 1 – Объединение вектора со вставкой чужеродной ДНК 2 – Введение рекомбинантного вектора в клетки 3 – Размножение клеток (получение клона клеток) или амплификация молекул нуклеиновых кислот - ПЦР

• 
  Слайд 12

  Выделение нуклеиновых кислот

  Прежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить содержащую ее суммарную ДНК

• 
  Слайд 13

  Фенольный метод выделения ДНК

  Нейтральные значения pH Кислые значения pH Водная фаза (ДНК и РНК) Водная фаза (РНК) Денатурированные белки Фенольная фаза Фенольная фаза (ДНК)

• 
  Слайд 14

  Взаимодействие ДНК с поверхностью стекла

  Гуанидинизотиоцианат Сорбция: кислые pH, высокая ионная сила Элюирование: щелочные pH, низкая ионная сила

• 
  Слайд 15

  Щелочной метод выделения бактериальных плазмид

  pH 8,0 Фрагменты линейной ДНК и кольцевая плазмидная ДНК pH 12,0 Кольца плазмидной ДНК остаются зацепленными друг за друга pH 8,0 Линейная ДНК агрегирует, кольцевая восстанавливается

• 
  Слайд 16

  Разделение нуклеиновых кислот

  Цель: обогащение препаратов нуклеиновых кислот нужными последовательностями

• 
  Слайд 17
  

  Аналитический электрофорез молекул ДНК в агарозном или полиакриламидном геле

• 
  Слайд 18

  Калибровочная кривая для определения размеров фрагментов ДНК

  kb = т.п.н. = тысячи пар нуклеотидов , mm 10 kb 1 kb

• 
  Слайд 19

  Формы плазмидной ДНК

  Суперскрученная Кольцевая ковалентно- замкнутая Релаксированная Линейная EcoRI Одно- цепочечный разрыв ДНК

• 
  Слайд 20
  

  Электрофоретическая подвижность разных форм плазмиды в присутствии бромистого этидия

  Бромистый этидий Релакс Линейная Супер. Увеличение отношения EtBr/ДНК Предел визуальной чувствительности – 50 нг ДНК/полоса

• 
  Слайд 21

  Ферменты, используемые в генной инженерии

  Генные инженеры используют элементы генетических систем, функционирующие в природе

• 
  Слайд 22
  

  Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерии

  Узнают специфические последовательности – сайты рестрикции Активны в виде димеров в присутствии ионов Mg2+ Изучено более 3000 и коммерчески доступно около 600 рестриктаз

• 
  Слайд 23

  Номенклатурарестриктаз класса II

  HaeI, HaeII, HaeIII – Haemophilus aegipticus, открыты в указанной последовательности Hinc и Hind – Haemophilus influenzae, штаммы cи d

• 
  Слайд 24

  Субстратная специфичность рестриктаз класса II

  Палиндромные сайты мелкощепящие: BglI (GGCC), крупнощепящие: EcoRI (GAATTC), NotI (GCGGCCGC) Частично вырожденные сайты HincII (GTYRAC, Y = pYrimidine, R = puRine), Разорванные сайты BglI(GCCN5GGC, N = aNy) Квазисимметричные сайты BtrI (CAC↓GTC, класс IIQ) Двойные сайты: SfiI (GGCCN5GGCC) Разрезание со смещением - классIIS (FocI GGATGN9,13Shifted cleavage) Последовательности липких концов уникальны Изменение субстратной специфичности в неоптимальных условиях EcoRI - GAATTC, EcoRI* - AATT (Mg2+ , органические растворители)

• 
  Слайд 25

  Изомеры рестриктаз

  Изошизомеры Рестриктазы разных видов бактерий, узнающие одинаковые сайты рестрикции и одинаково их расщепляющие. Метилчувствительные рестриктазы: HpaII иMspI (CCGG) – первый не расщепляет ДНК, если хотя бы один из остатков C метилирован; N-метилирование остатков A – Sau3A (иGATCи GMeATC), DpnI (только GMeATC), MboI (только GATC) Гетерошизомеры Узнают одинаковые сайты рестрикции, но по-разному их расщепляют (KpnI - G↓GTACC, Asp7181 - GGTAC↓C) Изокаудомеры Узнают разные сайты рестрикции, но создают одинаковые липкие концы. Лигирование с потерей сайта рестрикции Not I GC*GGCC GC Bsp120 I G*GGCC CBamHI/BclI/BglII/BstYI/DpnII

• 
  Слайд 26

  Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса II

  «Тупые» концы 5’-выступающие 3’-выступающие

• 
  Слайд 27
  

  Система бактериальной антивирусной защиты CRISPR/Cas CRISPR - Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsCas - CRISPR associated proteins

• 
  Слайд 28

  Два способа «затупления» липких концов ДНК

  Заполнение ДНК-полимеразой Удаление 3’->5’-экзонуклеазой или S1-нуклеазой

• 
  Слайд 29

  Механизм действия T4-ДНК-лигазы

  Восстановление фосфодиэфирной связи между соседними остатками дезоксирибозы на месте одноцепочечного разрыва ДНК Возможно лигирование фрагментов ДНК по «тупым» концам

• 
  Слайд 30

  Линкеры

  Лигирование по «тупым» концам Расщепление EcoRI Лигирование по «липким» концам, клонирование Создание новыхсайтоврестрикциина концах клонируемыхмолекул ДНК

• 
  Слайд 31

  Адаптеры

  Создание новыхсайтоврестрикциина концах клонируемыхмолекул ДНК без использования рестриктаз Лигирование по «тупым» концам (димеризации адаптеров не происходитиз-за отсутствия 5’-фосфат- нойгруппы) Фосфорилирование концов вставки Лигирование по «липким» концам, клонирование

• 
  Слайд 32

  Щелочная фосфатазаи полинуклеотидкиназа

  Щелочная фосфатаза: Оптимальные значения pH - щелочные Удаление 5’-фосфатных групп (дефосфорилирование) из ДНК, РНК и нуклеотидов Фосфатаза кишечника телят (calf intestinal phosphatase - CIP). Термолабильна Полинуклеотидкиназа бактериофага T4: Перенос γ-фосфатной группы ATP на 5’-OH-группу фрагментов ДНК (фосфорилирование). Введение радиоактивной метки, подготовка к лигированию

• 
  Слайд 33

  ДНК-зависимые ДНК-полимеразы

  ДНК-полимераза I (Pol I) (EC 2.7.7.7) Мол. масса 109 кДа, Активности: 5’->3’-полимераза, 5’->3’- и 3’->5’-(корректирующая) –экзонуклеазы. Введение концевой метки в ДНК, ник-трансляция, синтез 2-й цепи кДНК. Фрагмент Кленова: мол. масса 76 кДа (субтилизин), отсутствует 5’->3’-экзонуклеазная активность, введение метки, одноцепочечные зонды. Термостабильные ДНК-полимеразы T4-ДНК-полимераза Мол. масса 114 кДа, отсутствует 5’->3’-экзонуклеаза, введение метки, «шлифовка» концов ДНК 3’->5’- экзонуклеазой. T7-ДНК-полимераза «Секвеназа» - искусственно снижена 3’->5’- экзонуклеазная активность, повышены процессивность и скорость синтеза ДНК. «Термосеквеназа» - получена из Taq-ДНК-полимеразы – повышено сродство к ddNTPs, снижена активность 5’->3’-экзо

• 
  Слайд 34

  Обратные транскриптазы(ОТ)

  ОТ вируса миелобластоза птиц (AMVRT) – димер, хорошо транскрибирует сильно структурированные матрицы ОТ вируса мышиного лейкоза Молони (M-MLV RT)– мономер, рекомбинантный фермент OT ВИЧ-1 – транскрибирует как РНК, так и ДНК Нуждаются в ДНК-затравке (праймере) Обладают активностью РНКазы H, деградирует РНК-матрицу в процессе синтеза первой цепи Мутанты рекомбинантной M-MLV RT без РНКазы H более эффективны в синтезе первой цепи кДНК Высокая частота ошибок – до 5 х 10–3/нуклеотид

• 
  Слайд 35

  Три стратегии синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазой

  Случайный праймер Олиго(dT)-праймер Специфический праймер

• 
  Слайд 36

  SMART-синтез кДНК

  Олиго-dC присоединяется независимо от матрицы обратной транскриптазой Олиго-dG с адаптером исходно добавлен в реакционную смесь и используется ОТ в качестве матрицы для завершения синтеза первой цепи кДНК

• 
  Слайд 37

  Векторы

  Молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала в клетки живых организмов Векторы для клонирования (Cloning vectors) Экспрессирующие векторы (Expressionvectors) Векторы для слияния генов (Gene fusion vectors) Бинарные (челночные) векторы (Shuttle vectors)

• 
  Слайд 38

  Свойства, которыми должен обладать любой вектор

  Способность к длительному существованию в клетках-хозяевах (репликация автономная или в составе хромосом) Наличие биохимических или генетических маркеров, которые позволяют обнаруживать его присутствие в клетках Должны допускать встраивание чужеродной ДНК без нарушения своей функциональной целостности

• 
  Слайд 39

  Плазмидные векторы

• 
  Слайд 40

  Плазмидный вектор pUC18

  bla– Ген β-лактамазы, селектируемый маркер (устойчивость ампициллину) ori–Точка начала репликации (origin) lacZ‘–N-концевая часть гена β-галактозидазы (кодирует146 из 1021 АК- остатков), селектируемый маркер (хромогенный субстрат X-Gal) lacI–Ген Lac-репрессора (Индуктор – IPTG) Полилинкер

• 
  Слайд 41

  Плазмидный вектор Bluescript

  Promega Фагмида(Phagemid) Заражение бактериальных клеток, содержащих фагмиды, фагом-помощником, приводит к синтезу одноцепочечной ДНК фагмиды и ее упаковке в фаговые частицы

• 
  Слайд 42

  TA-Клонирование продуктов ПЦР

  Taq-ДНК-полимераза образует в продукте ПЦР 3’-выступающие A-концы независимо от матрицы

• 
  Слайд 43

  Структура бактериального гена и его некоторых сильных промоторов

  terminator Регуляторная часть гена Структурная часть гена

• 
  Слайд 44

  Регуляция экспрессии генов в векторе pET

  Бактериальная клетка BL21DE Novagene

• 
  Слайд 45

  Искусственные хромосомы

• 
  Слайд 46

  Искусственная хромосома дрожжей YAC(Yeast Artificial Chromosome)

  >2000 т.п.н. ura3 – ген оротидин- 5’-фосфатдекарбоксилазы жизненноважный: позитивный отбор 5-фтороротовая кислота (нетоксична) 5-фторурацил (токсичен) негативный отбор 5-ФОК

• 
  Слайд 47

  Бактериальная искусственная хромосома (BAC)

  Cmr oriS repE parA parB parA, parB– контроль числа копий (1-2) Cmr – селектируемый маркер oriS, repE – односторонняя репликация cosN– сайт терминазы λ loxP – cre-рекомбиназа фага P1 cosN loxP Емкость – 300 т.п.н. Стабилен на протяжении 100 генераций

• 
  Слайд 48

  Емкости векторов разных классов

• 
  Слайд 49
  

  Генная инженерия без клонирования – Полимеразная цепная реакция

• 
  Слайд 50
  

  Кари Б. Муллис(KaryB. Mullis) – изобретатель полимеразной цепной реакции (ПЦР)

  Американский биохимик 1944 г.р. Патент - 1985 г., фирма Cetus Corp. California Нобелевская премия по химии – 1993 г.

• 
  Слайд 51
  
• 
  Слайд 52
  
• 
  Слайд 53
  
• 
  Слайд 54
  
• 
  Слайд 55

  Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл

• 
  Слайд 56

  Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл

• 
  Слайд 57

  Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР

• 
  Слайд 58

  Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов)

  a – начальная денатурация ДНК b – собственно реакция с – достройка цепей ДНК d – хранение 4°С

• 
  Слайд 59

  ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)

  После 6 циклов ПЦР образуется 64 идентичных копии исходного генетического локуса (ампликона) Ни одна реакция в цикле не доходит до конца

• 
  Слайд 60
  

  Количественная ПЦРПЦР в реальном времениReal-time PCRПозволяет, не открывая пробирки, непрерывно следить за накоплением продуктов ПЦР в пробах

• 
  Слайд 61

  Устройство капиллярного амплификатора LightCycler

  Капилляры объемом 20 мкл обеспечивают высокое соотношение поверхности к объему и высокую скорость теплообмена. 30 циклов завершаются за 20-30 мин

• 
  Слайд 62

  Принцип действия зондов TaqMan

  5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель, который начинает флуоресцировать в реакционной смеси Флуорофор Гаситель флуоресценции

• 
  Слайд 63
  

  Принцип действия зондов – «молекулярных маяков» (molecular beacon probes)

  В растворе зонды образуют структуру «стебель-петля», что приводит к сближению флуорофора и гасителя флуоресценции

• 
  Слайд 64

  Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времени

  Праймеры «Амплифлюр» Праймеры «Скорпион»

• 
  Слайд 65
  

  Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания реакции

  СT СT–пороговый цикл

• 
  Слайд 66

  Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в пробе

  Определение числа плазмидных копий гена F8в трансфицированных клетках человека Концентрация ДНК в крайних точках различается на 9 порядков

• 
  Слайд 67

  Цифровая ПЦР

  Позволяет считать отдельные молекулы матричной ДНК в исследуемых образцах

• 
  Слайд 68

  Новые системы секвенирования ДНК второго и третьего поколений

• 
  Слайд 69

  Центр по секвенированию ДНК методом Сэнгера

  Одна машина может анализировать 96 образцов одновременно (96 капилляров), 750 п.н. за один прогон, 6 прогонов в день, Итого: одна машина может определять ~345 600 п.н. в один день

• 
  Слайд 70

  Система секвенирования ДНК второго поколения

  1 2 3 Фрагментация ДНК Лигирование адаптера Получение полимеразных колоний фрагментов ДНК Циклическое секвенирование микроматрицы Одновременно секвенируются миллионы молекул ДНК За один прогон прибора секвенируются более 1 миллиарда нуклеотидов ДНК – 1000-кратное увеличение производительности

• 
  Слайд 71

  Эмульсионная (эм)ПЦР на микрочастицах с иммобилизованным праймером

  Начало 1-го цикла эмПЦР Начало 2-го цикла эмПЦР Начало 3-го цикла эмПЦР эмПЦР Матрица оцДНК Синтезированная цепь ДНК Праймеры Гидрофобная фаза эмПЦР

• 
  Слайд 72

  Секвенатор второго поколения фирмы Illumina

  Производительность – 600 Gb (6 x 1011bp) за 11 дней; Макс. длинасеквенируемого фрагмента – 2 x 100 bp; Секвенирование синтезом, молек. колонии - кластеры на стекле

• 
  Слайд 73
  

  Цех секвенаторов 2-го поколения в Китае Фирма BGI-Shenzhen, ноябрь 2011

• 
  Слайд 74

  Секвенатор третьего поколения PacBioRSфирмы Pacific Biosciences

  Система коммерциализирована и активно продается в течение последнего года

• 
  Слайд 75

  Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе

  Возбуждение Эмиссия Меченые dNTPs Включившийся dNTP Одна молекула ДНК-полимеразы иммобилизована на дне каждого волновода Флуорофор присоединен к γ-фосфатной группе нуклеотида-субстрата

• 
  Слайд 76

  Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипе

  Включающийся в ДНК меченый нуклеотид задерживается в объеме считывания флуоресценции в течение миллисекунд, свободно диффундирующий нуклеотид – в течение наносекунд. Включение обнаруживается в виде вспышки света определенной длины волны, характерной для конкретного нуклеотида..

• 
  Слайд 77

  Секвенирование через нанопоры

  Уникальная последовательность Гомополимер Часть мембраны с нанопорой, через которую проходит одноцепочечная ДНК Изменения силы тока, проходящего через мембрану, под действием отдельных нуклеотидов ДНК

• 
  Слайд 78
  

  Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании через нанопоры

  Время

• 
  Слайд 79
  

  Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2014 г)

  Производительность 1 млрд нуклеотидов за 6 часов. Ср. длина считывания: 5,4 kb. Десятки тысяч нуклеотидов/1 прогон Компьютер – ноутбук с USB-разъемом Стоимость ~$900 Дэвид Димер (David Deamer) - Предложил принцип метода секвенирования через нанопоры в 1989 году 2014 – секвенирован бактериальный геном A good first shot, but not a game-changer — yet!

• 
  Слайд 80
  

  «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов, а не новых концепций. Новые концепции объясняют известные явления по-новому. Новые методы открывают новые явления, которые необходимо объяснить.»Freeman J. Dyson