Презентация на тему "Лабораторная энзимодиагностика"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Лабораторная энзимодиагностика

  ЛЕКЦИЯ Д. м. н. Соловьев В.Г.

• 
  Слайд 2
  

  ФЕРМЕНТЫ (энзимы)- органические вещества белковой природы, которые синтезируются в клетках и во много раз ускоряют протекающие в них реакции, не подвергаясь при этом химическим превращениям

• 
  Слайд 3
  

  Схема ферментативной реакции Е – фермент; S – субстрат; ES – комплекс «фермент-субстрат»; Р1, Р2 – продукты реакции; К1, К2, К3 – константы равновесия.

• 
  Слайд 4

  Типы специфичности ферментов

  Стереохимическая - (L- аспартатдекарбоксилаза) Абсолютная (субстратная) - (глюкокиназа) Относительная (групповая) - (трипсин, цитохром Р450) Свойства ферментов 1. Высокая биологическая активность 2. Лабильность – способность к небольшим изменениям нативной конформации, ведущая к уменьшению каталитической активности 3.Высокая специфичность

• 
  Слайд 5
  

  Свойства ферментов 4) Зависимость ферментативной активности от физико-химических параметров среды Основные факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции: 1. Концентрация субстрата; 2. Концентрация фермента; 3. рН среды; 4. Температура среды; 5. Активаторы и ингибиторы

• 
  Слайд 6
  

  Активность ферментачисленно равна скорости ферментативной реакции в оптимальных условиях на начальном линейном участке кинетической кривой при насыщающей концентрации субстрата

• 
  Слайд 7
  

  L. Michaelis 1875-1949 M. Menten 1879-1960 Зависимость от параметров среды

• 
  Слайд 8
  

  аспартат амино трансфер аза аспартатаминотрансфераза Кодовое название (шифр) 1.1.1.38 - малатдегидрогеназа Номенклатура ферментов Систематическое название

• 
  Слайд 9
  

  Изоферменты – ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, кинетическим параметрам, условиям активации, особенностям связи апофермента и кофермента Изоферменты лактатдегидрогеназы (ЛДГ) Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н М М М М М М М М М М ЛДГ1 ЛДГ4 ЛДГ3 ЛДГ2 ЛДГ5 Н М Heart (англ.) - сердце Muscle (англ.) - мышца

• 
  Слайд 10
  

  Скорость реакции (V) –скорость, с которой уменьшается концентрация субстрата илиувеличивается концентрация продуктов реакции Скорость ферментативной реакции Скорость катализируемой ферментом реакции, а значит и его активность зависит от условий инкубации. Так, повышение температуры всего на 1 °С приводит к увеличению скорости реакции на 2,5-20%, поэтому определение активности фермента проводят при фиксированных режимах (допустимо колебание ± 0,1°С). Концентрацию продукта реакции или субстратов можно определить следующими способами: 1. Прямое фотометрирование; 2. Окрашивание продукта или субстрата красителями; 3. Тест Варбурга

• 
  Слайд 11
  

  Спектр поглощения НАДН и НАД

• 
  Слайд 12
  

  Способы измерения скорости реакции А/мин = (А– А хол)/t А/мин = (А2– А1)/t А/мин = А ср/t

• 
  Слайд 13
  

  1. По калибратору 2. По калибровочной кривой 3. По коэффициенту экстинкции продукта или кофермента в восстановленной форме (НАДН, НАДФН) Расчет ферментативной активности Формула Бугера-Ламберта-Бера: Е = (∆А/мин хVх 1000) : (εхl хv), где Е – активность фермента, Е/л; ΔA/мин – изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин, ед. опт. плотности/мин; V – объем реакционной смеси, мл; ε – миллимолярный коэффициент экстинкции, л/ммоль × см; l – длина оптического пути, см; v – объем пробы (сыворотки), мл; 1000 – коэффициент пересчета активности в мкмоль/(мин Ч л).

• 
  Слайд 14
  

  Единицы измерения скорости реакции Международная единица активности (U, МЕ, Е, Ед) - это количество фермента, которое катализирует превращение 1мкмоля субстрата или получение 1 мкмоляпродукта в минуту в стандартных условиях. Единица активности в системе СИ (катал) соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата в секунду. 1 катал = 6×107 МЕ 1 МЕ = 16, 67 × 10-9 катал

• 
  Слайд 15
  

  Основные правила в лабораторной энзимологии 1. Нельзя сильно встряхивать растворы ферментов и допускать образование пены при их перемешивании, так как ферменты при этом могут инактивироваться в результате воздействия на них кислорода воздуха; 2. Растворенные, лиофильно высушенные реагенты, контрольные материалы и контрольные сыворотки, содержащие ферменты, перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре в течение времени, указанного в инструкции, чтобы фермент пришел в конформационно-активное состояние;

• 
  Слайд 16
  

  Основные правила в лабораторной энзимологии 3. Время начала и окончания ферментативной реакции следует фиксировать по секундомеру, причем в случае определения активности ферментов и кинетических методов определения аналитов для каждой отдельной пробы, а не для серии целиком, иначе результаты анализа будут неверны; 4. Перед началом ферментативной реакции температуру рабочего реагента необходимо довести до значения, указанного в инструкции, и обеспечить его поддержание в течение всего времени анализа с точностью ±0,1°С;

• 
  Слайд 17
  

  Основные правила в лабораторной энзимологии 5. Нельзя изменять соотношение «рабочий реагент/сыворотка». Его уменьшение в целях экономии может привести к получениюзаниженных результатов. При увеличении соотношения «рабочий реагент/сыворотка» снижается чувствительность метода; 6. Нельзя разбавлять рабочий реагент в целях экономии, так как при этом условия реакции (концентрация буфера, активаторов и т. д.) отклонятся от оптимальных, что приведет к занижению результатов;

• 
  Слайд 18
  

  Основные правила в лабораторной энзимологии 7. Если активность фермента или другого аналита в биологической жидкости превышает верхнюю границу линейности набора, то исследуемую пробу необходимо разбавить строго в соответствии с рекомендациями, изложенными в инструкции к набору (чем разбавлять и во сколько раз); 8. Фотометрирование следует проводить в указанном в инструкции диапазоне длин волн, отклонение может существенно снизить чувствительность метода. В случае расчета концентрации аналита или активности фермента по коэффициенту экстинкции длина волны должна точно соответствовать указанной в инструкции;

• 
  Слайд 19
  

  Основные правила в лабораторной энзимологии 9. Длина оптического пути кюветы для фотометрирования должна соответствовать указанной в инструкции. Использование кюветы с меньшей длиной пути снизит чувствительность метода; 10. При построении калибровочных кривых необходимо делать не менее 4–5 параллельных определений холостой пробы и каждого стандартного образца указанной в инструкции концентрации. Строить калибровочную кривую следует для каждой серии набора, а также при смене фотометрического оборудования.

• 
  Слайд 20
  

  Основные правила в лабораторной энзимологии 11. Калибровочную пробу, используемую для расчета концентрации аналита или активности фермента, необходимо ставить для каждой серии анализов в четырех параллелях; 12. При работе с ферментативными наборами так же, как и при работе с другими наборами реагентов, желательно, а при отборе проб малых объемов (30–10 мкл) обязательно следует пользоваться поверенными автоматическими микродозаторами;

• 
  Слайд 21
  

  Основные правила в лабораторной энзимологии 13. Рекомендуется как можно быстрей отделять сыворотку от сгустка. Хранение сыворотки также неблагоприятно сказывается на результатах определения активности многих ферментов (они занижаются), поэтому следует измерять активность ферментов в сыворотке в день взятия крови у пациента; 15. Следует строго соблюдать условия хранения ферментативных наборов и их компонентов, указанные в инструкции, так как ферменты – термолабильные катализаторы. Хранение их при более высокой температуре может привести к быстрой инактивации. Некоторые ферменты в растворепри замораживании частично или полностью инактивируются.

• 
  Слайд 22
  

  Ферменты плазмы (сыворотки) крови 1. Плазмоспецифические (выполняют свою функцию в плазме крови): ферменты свертывающей, противосвертывающей, фибринолитической систем и др. Б) О гипофункции органа, их синтезирующего (печень) А) О наличии специфического патологического процесса (например, гемофилия ) Диагностическое значение имеет снижение активности О чем это свидетельствует?

• 
  Слайд 23
  

  Ферменты плазмы (сыворотки) крови 2. Органоспецифические: синтезируются в клетках различных тканей, где и выполняют свои функции Гепатоциты (АЛТ, АСТ, ЛДГ5) Кардиомиоциты (АСТ, КФК, ЛДГ1) Диагностическое значение имеет повышение активности Это свидетельствует о разрушении клеток, синтезирующих данные ферменты: Поджелудочная и слюнные железы (амилаза) Простата (кислая фосфатаза) Желчные протоки (γ-ГТФ)

• 
  Слайд 24
  

  Задание к зачету (заполнить таблицу)