Презентация на тему "МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Г.СЕМЕЙ КАФЕДРА МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГИСТОЛОГИИ Зав. кафедрой: д.б.н., профессор Мынжанов М.Р.СРСТема: Молекулярно-генетические методы исследования."

Содержание

• 
  Слайд 1
  

  МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Г.СЕМЕЙ КАФЕДРА МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГИСТОЛОГИИ Зав. кафедрой: д.б.н., профессор Мынжанов М.Р.СРСТема: Молекулярно-генетические методы исследования.

• 
  Слайд 2
  

  План:1.Введение.2.Сущность молекулярно-генетических методов.3.Виды молекулярно-генетических методова)Саузерн-блоттингб)ПЦРв)Гибридизацияг)Анализ полиморфизма длины рестрикционных элементов4. Заключение5. Список использованной литературы

• 
  Слайд 3
  

  Молекулярно-генетические методы- большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК.

• 
  Слайд 4
  
• 
  Слайд 5
  

  Важнейший этап идентификации гена - его выделение. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают: быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации в этаноле.

• 
  Слайд 6
  

  В генетических лабораториях ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего у пациента забирают 5-20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором антикоагулянта (гепарин). Затем отделяют лейкоциты и проводят их обработку по изложенным выше этапам.

• 
  Слайд 7
  

  Следующий этап подготовки материала к исследованию - «разрезание» ДНК на фрагменты в участках со строго специфической последовательностью оснований, которое осуществляют с помощью бактериальных ферментов - рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз). Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разделяют её на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов - характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК.

• 
  Слайд 8
  

  Для получения ДНК-зондов используют метод клонирования генов. Сущность метода состоит в том, что фрагмент ДНК, соответствующий какому-либо гену или участку гена, встраивают в клонирующую частицу, как правило, бактериальную плазмиду (кольцевая внехромосомная ДНК, при­сутствующая в клетках бактерий и несущая гены устойчивости к антибио­тикам), и затем бактерии, имеющие плазмиду со встроенным человеческим геном, размножают. Благодаря процессам синтеза в плазмиде удаётся получить миллиарды копий человеческого гена или его участка. В дальнейшем полученные копии ДНК, меченные радиоактивной меткой или флюорохромами, используют в качестве зондов для поиска комплементарных последовательностей среди исследуемого пула молекул ДНК. В настоящее время существует множество разновидностей методов с использованием ДНК-зондов для диагностики генных мутаций.

• 
  Слайд 9

  Саузерн-блоттинг

  Саузерн-блоттинг (разработан Э. Саузерном и Р. Дэйвисом в 1975 г.) - основной метод, с помощью которого в настоящее время выявляют гены определённого заболевания. Для этого ДНК из клеток больного экстрагируют и обрабатывают одной из рестрикционных эндонуклеаз (или несколькими). Полученные фрагменты подвергают электрофорезу, который позволяет разделить их по размеру (фрагменты меньшего размера двигают­ся через поры геля быстрее). Затем фрагменты переносят (перепечатывают) на нитроцеллюлозный фильтр, на который наслаивают меченный радио­активной меткой зонд. Зонд связывается только с комплементарной последовательностью. Затем методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Гибридизацию с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или РНК, нанесённых капельно на твёрдый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре (округлой или продолговатой соответственно).

• 
  Слайд 10

  Гибридизация in situ

  Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации insitu. Вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, мечен­ные флюорохромами,  FISH (fluorescein in situ hybradization). Меченный ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашен­ных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом применяется для облегчения доступа зонда к геномной ДНК. После отмывки несвязанных молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченных ДНК-зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных используемому ДНК-зонду, можно непосредственно выявлять при микроскопии в виде ха­рактерных точек над соответствующими участками определённых хромосом. Данный метод исследования позволяет определить не только хромосомную принадлежность, но и внутрихромосомную локализацию исследуемого гена.

• 
  Слайд 11

  Полимеразная цепная реакция 

  ПЦР - новое достижение молекулярной генетики, используется для aмплификации ДНК и позволяет быстро размножить in vitro специфический участок ДНК (то есть любой интересующий ген) более чем в 200 000 раз. Чтобы провести реакцию, достаточно иметь ДНК-материал одной клетки; количество амплифицированной с помощью ПЦР ДНК столь велико, что эту ДНК можно просто окрашивать (использование радиоактивных зондов после электрофореза не требуется). Необходимое условие для проведения ПЦР - знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК для правильного подбора искусственно синтезированных праймеров.

• 
  Слайд 12
  
• 
  Слайд 13
  

  ПЦР протекает автоматически в программируемом термостате - термоциклере (амплификаторе). Трёхступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной ДНК, повторяют 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в реакционной смеси. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не вследствие изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразной границы амплифицированного участка, что и определяет размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.

• 
  Слайд 14
  

  В качестве метода детекции полученных молекул ДНК используют электрофорез, с помощью которого производится разделение амплифицированного материала по размеру ампликонов (продуктов амплификации). С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК. 

• 
  Слайд 15

  Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов

  Для выделения полиморфных участков ДНК применяются бактериальные ферменты - рестриктазы, продуктом которых являются сайты рестрикции. Спонтанные мутации, возникающие в полиморфных сайтах, делают их резистентными или, наоборот, чувствительными к действию специфичной рестриктазы.

• 
  Слайд 16
  

  Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть обнаружена по изменению длины рестрикцированных фрагментов ДНК, путём разделения их с использованием электрофореза и последующей гибридизации со специфическими ДНК-зондами. При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах будет выявляться один крупный фрагмент, а при её наличии будет присутствовать меньший по размеру фрагмент. Наличие или отсутствие сайта рестрикции в тождественных локусах гомологичных хромосом позволяет достаточно надёжно маркировать мутантный и нормальный ген и проследить его передачу потомству. Таким образом, при исследовании ДНК пациентов, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофореграмме будут выявляться короткие фрагменты ДНК. У пациентов, гомо­зиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будут выявляться фрагменты большей длины, а у гетерозиготных - короткие и длинные фрагменты.

• 
  Слайд 17

  Заключение

  Молекулярно-генетический анализ - это единственная на сегодняшний день возможность выявить генетическую предрасположенностьк различным болезням задолго до их возникновения.Генетическое исследование – это прогнозирование заболеваний с целью их предупреждения, а не диагностика уже имеющихся болезней.   Что дает генетическое исследование?   Большинство распространенных заболеваний - повышенное артериальное давление, инфаркт, бронхиальная астма, сахарный диабет, онкологические заболевания и многие другие - «предопределены» в наших генах. С помощью генетического анализа можно достоверно узнать, носителем какого генотипа Вы являетесь, и составить Вашу персональную «Генетическую карту здоровья».   Молекулярно-генетический анализ - надежен и высоко информативен. Это исследование  выполняется он всего один раз, так как результат исследования не меняется на протяжении всей жизни

• 
  Слайд 18
  

  Список используемой литературы:http://spbgspk.ru/ http://ru.wikipedia.orgkcrm.ruropab.ru/lab/molecular-genetics.html