Презентация на тему "Hla типирование"

Содержание

• 
  Слайд 1

  HLA типирование

  Подготовил: студент 471 группы МБФ Василий ЦветковПреподаватель: доцент, д.м.н. Соколова Е.В. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Москва 2015

• 
  Слайд 2

  История открытия

  В 20-е годы XX века американские ученые Литтл (G.D. Little) и Снелл (G. Snell) c соавторами установили существование более 30 генетических локусов, различие в которых приводит к отторжению трансплантатов Они обозначили их как локусы гистосовместимости (H-локусы) Одновременно с Литтлом и Снеллом английский иммунолог Горер (P. Gorer) решил аналогичную проблему при изучении групп крови у мышей В 1948 году в совместной работе Снелла и Горера описан локус гистосовместимости, связанный с наиболее сильным отторжением. Он был назван H-2

• 
  Слайд 3

  …

  В 60-е годы французский иммуногематологДоссе (J. Dausset) описал несколько лейкоцитарных антигенов у человека, сходных с продуктами локусов H-2. Открытый генетический комплекс получил название HLA Позднее аналогичные комплексы были обнаружены у всех исследуемых млекопитающих и птиц и были названы MHC

• 
  Слайд 4

  Определение

  Главный комплекс гистосовместимости- комплекс тесно сцепленных генетических локусов (и их белковых продуктов), ответственных за развитие иммунного ответа и синтез трансплантационных антигенов

• 
  Слайд 5

  Основные физиологические функции ГКГС

  Обеспечение взаимодействия клеток организма Обеспечение процессинга (переработки) и презентации пептидов – индукторов и мишеней иммунного ответа Распознавание собственных, измененных собственных и чужеродных клеток => запуск и реализация иммунного ответа против носителей генетической чужеродности Поддержание иммунологической толерантности (в том числе во время беременности) Участие в позитивной и негативной селекции T-лимфоцитов Создание генетического разнообразия и обеспечение выживаемости вида

• 
  Слайд 6

  Основные свойства ГКГС

  Полигенность (открыто более 200 генов, входящих в состав главного комплекса гистосовместимости) Полиморфность (для значительной части генов системы гистосовместимости существуют множественные аллельные варианты) Кодоминантность (в гетерозиготном состоянии проявляются оба аллельных варианта)

• 
  Слайд 7

  ГКГС состоит из 3 классов

• 
  Слайд 8

  Антигены I класса

  Классические антигены ГКГС представляют собой эпитопы к Т-клеточному рецептору CD8+Т-лимфоцитов Неклассические антигены ГКГС проявляют ограниченный полиморфизм, паттерны экспрессии и презентируемые антигены. Эту группу можно разделить на гены, закодированные в локусе 1 класса ГКГС (такие как HLA-E, -F, -G), и остальные (например, стресс-индуцированные лиганды)

• 
  Слайд 9

  Антигены II класса

  Классические антигены ГКГС презентируют антигены CD4+ лимфоцитам Неклассические антигены ГКГС локализованы не на поверхности мембраны, а в лизосомах, способствуя загрузке антигенных пептидов в пептид-связывающие белки второго класса

• 
  Слайд 10

  Классические антигены ГКГС

• 
  Слайд 11

  Неклассические антигены ГКГС

• 
  Слайд 12

  Наследование антигенов ГКГС

  Аллельные формы генов ГКГС наследуются кодоминантно, как сцепленные группы, называемые гаплотипами

• 
  Слайд 13

  Антигены ГКГС I класса

  Располагаются на клеточной мембране (трансмембранный гликопротеин) Представляют из себя гетеродимер (белок состоит из 2 разных субъединиц) α-цепь заякорена в мембране и включает в себя 3 домена (α1, α2, α3) β-цепь (β2-микроглобулин) с мембраной не связана, прикреплена к α-цепи нековалентно β2-микроглобулин не полиморфен и кодируется генами, расположенными в 15 хромосоме Домен α3 и β-цепь по структуре относятся к суперсемейству иммуноглобулинов Домен α3 способен связываться с молекулой CD8 Домены α1 и α2 образуют особую структуру – щель/бороздку Бьоркмана, в которую встраивается антигенный пептид длиной 9-13 аминокислот, заякоренный в двух местах

• 
  Слайд 14

  Строение антигенов ГКГС I класса

  Иллюстрация из книги Дэвида Вагнера «Type 1 Diabetes - Pathogenesis, Genetics and Immunotherapy» 2011

• 
  Слайд 15

  Какие клетки экспрессируют гены ГКГС I класса?

  Продукты генов MHC I класса экспрессируются (располагаются) на мембранах ВСЕХ соматических клеток Исключение составляют эритроциты (лишены ядра) и клетки ворсинчатого трофобласта (обеспечение толерантности к плоду; на трофобластеэкспрессированы неклассические молекулы MHC I)

• 
  Слайд 16

  Антигены ГКГС IIкласса

  Располагаются на клеточной мембране (трансмембранный гликопротеин) Представляют из себя гетеродимер (белок состоит из 2 разных субъединиц) α-цепь и β-цепь заякорены в мембране и включает в себя по 2 домена (α1, α2 и β1, β2, соответственно) Домен α2 и β2 по структуре относятся к суперсемейству иммуноглобулинов Домены α1 и β1 образуют особую структуру – щель/бороздку Бьоркмана, в которую встраивается антигенный пептид длиной 12-25 аминокислот. Он заякорен в 5 местах и плотно прилегает к ГКГС II класса

• 
  Слайд 17

  Строение антигенов ГКГС IIкласса

  Иллюстрация из книги Дэвида Вагнера «Type 1 Diabetes - Pathogenesis, Genetics and Immunotherapy» 2011

• 
  Слайд 18

  Какие клетки экспрессируют ГКГС II класса?

  Продукты генов MHC II класса постоянно экспрессируются на мембранах антигенпредставляющих клеток (дендритные клетки, макрофаги, B-лимфоциты) Молекулы MHC II могут присутствовать на мембранах нейтрофилов, тучных клеток, базофилов, эозинофилов, при стимуляции появляются на эпителии и эндотелии

• 
  Слайд 19

  Щель Бьоркманапредназначена для встраивания в нее антигенного пептида

  У MHC I класса Образована доменами α1и α2 Вмещает пептид размером 9-13 а/к Встраиваемый пептид имеет эндогенное происхождение У MHC II класса Образована доменами α1 и β1 Вмещает пептид размером 12-25 а/к Встраиваемый пептид имеет экзогенное происхождение

• 
  Слайд 20

  Роль ГКГС в иммунных процессах

  Взаимодействуя с CD4 рецепторами на поверхности Т-хелперов, антигены II класса ГКГС модулируют приобретенный иммунитет Взаимодействуя с CD8 рецепторами на поверхности цитотоксических Т-лимфоцитов, антигены I класса ГКГС вызывают элиминацию инфицированных и злокачественных клеток. Таким образом антигены I класса ГКГС способствуют работе клеточного иммунитета Опосредованно антигены III класса ГКГС участвуют в работе гуморального иммунитета

• 
  Слайд 21

  Методы исследования ГКГС

• 
  Слайд 22

  При типировании определяют:

  Гаплотип(набор генов HLA на одной из гомологичных хромосом) – определяют с помощью типирования родителей Генотип (набор генов на двух хромомсомах) Фенотип (антигенное представительство молекул HLA на поверхности клеток)

• 
  Слайд 23

  Реакция лейкоагглютинации

  Это метод определения тканевой совместимости донора и реципиента, основанный на феномене агглютинации лейкоцитов донора под действием антилейкоцитарныхантител (т.е. метод направлен на определение в сыворотке реципиента АТ против HLA-молекул донора) Постановка: Ряд разведений исследуемой сыворотки реципиента Добавление взвеси лейкоцитов донора Встряхивание и инкубация Центрифугирование Удаление супернатанта и лизис э/ц уксусной кислотой Мазок для микроскопирования

• 
  Слайд 24

  Учет реакции лейкоагглютинации

  Выраженность агглютинации: интенсивная, т.е. крупные агломераты, значительная площадь свободной жидкости ++++ выраженная- наряду с агломератами лейкоцитов в жидкости можно видеть небольшое количество свободных меток +++ средняя - среди взвешенных клеток выявляются островки агглютинатов++ слабая мелкоглыбчатая- преобладают свободные клетки, но встречаются небольшие комочки склеившихся клеток + Разведение сыворотки, в которой еще отмечается агглютинация Минусы: Низкая воспроизводимость рез-ов Неспецифическая агглютинация Спонтанная агглютинация при высокой концентрации нежизнеспособных Лц

• 
  Слайд 25

  Лимфоцитотоксический тест

  Метод заключается в следующем: К сывороткам против разных антигенов HLA добавляют по 2000 исследуемых лимфоцитов. После инкубации добавляют комплемент Лимфоциты, несущие антиген, против которого направлена сыворотка, под действием комплемента разрушаются. Затем к лимфоцитам добавляют краситель, который окрашивает только живые клетки (также можно исп-ть51Cr) Результат оценивают по относительному числу погибших лимфоцитов Резко положительный результат свидетельствует о том, что лимфоциты несут исследуемый антиген.

• 
  Слайд 26

  СКЛ

  Применяют в основном для определения HLA II класса В качестве «-» контроля используются культуры, состоящие только из отвечающих клеток В качестве «+» контроля - культура отвечающих клеток, стимулированных смесью лимфоцитов от разных доноров Если радиоак-тьв СКЛ >радиоак-тив «-» контроле не более чем на 20% или составляет не более 20% от радиоак-тив «+» контроле, считают, что донор и реципиент совместимы по антигенам HLA

• 
  Слайд 27

  Молекулярно-генетические методы

  В настоящее время молекулярно- генетические методы используются только для типирования генов HLA класса II. Анализ полиморфизма длин рестрикционныхфрагментов Определение специфических олигонуклеотидныхпоследовательностей ПЦР

• 
  Слайд 28

  I. Анализ полиморфизма длин рестрикционныхфрагментов

  Метод основан на способности бактериальных эндонуклеаз расщеплять ДНК в сайтах рестрикции (участки, в которых сосредоточены специфические для определенной эндонуклеазы последовательности нуклеотидов) Длину рестрикционных фрагментов оценивают методом гибридизации ДНК на твердой подложке

• 
  Слайд 29
  

  Постановка: Фрагменты ДНК, полученные после ее обработки эндонуклеазами, разделяют с помощью электрофореза в геле Переносна нитроцеллюлозную мембрану и инкубация с мечеными фрагментами ДНК, комплементарными уникальным нуклеотидным последовательностям какого-либо аллеля гена HLA Выявление фрагментов, с которыми связались меченые фрагменты ДНК, и определение их длины (по длине пробега фрагментов ДНК в геле) Учет: По длине фрагментов судят о присутствии тех или иных аллелей HLA у исследуемого Если у донора и реципиента выявляются фрагменты одинаковой длины, считается, что они несут одинаковый аллель HLA

• 
  Слайд 30
  

  Недостатки метода: большие затраты времени (обычно 2-3 нед); невозможность различить аллели, сайты рестрикции в которых расположены в одних и тех же участках; большое количество клеток для исследования (для получения достаточного количества ДНК необходимо по крайней мере 10-15 млн клеток); отсутствие эндонуклеаз, специфичных для определенных аллелей.

• 
  Слайд 31

  II. Определение специфических олигонуклеотидныхпоследовательностей

  Аллели генов HLA иногда отличаются друг от друга лишь по одной паре нуклеотидов Синтезированы одноцепочечныеолигонуклеотидныезонды, состоящие из 19-24 нуклеотидов, полностью комплементарные уникальным последовательностям каждого известного аллеля гена HLA Созданы также зонды, комплементарные общим для нескольких аллелей последовательностям Т.о., для определения неизвестного аллеляможно последовательно использовать серию зондов разной специфичности Для гибридизации с олигонуклеотидными зондами можно использовать как рестрикционные фрагменты ДНК, полученные с помощью эндонуклеаз, так и фрагменты ДНК, полученные с помощью полимеразной цепной реакции

• 
  Слайд 32

  III. ПЦР

  метод избирательной амплификации, предназначенный для получения большого количества копий фрагментов ДНК с определенной нуклеотидной последовательностью Достоинства метода: высокая чувствительность высокая специфичность прост в исполнении нет необходимости в сложной очистке матрицы подходит практически любой материал Реакция проводится в программируемом термостате – амплификаторе

• 
  Слайд 33

  Компоненты реакции

  Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. Термостабильная ДНК-полимераза — полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermusaquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcusfuriosus (Pfu-полимераза), Pyrococcuswoesei (Pwo-полимераза) и другие. dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции —pH, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

• 
  Слайд 34

  Стадии (обычно 20-40 циклов)

  Денатурация ДНК - получение двух однонитевых фрагментов (90-95°C, 5-90сек) (перед первым циклом – прогрев чтобы цепи полностью разошлись) Денатурация Элонгация Отжиг Отжиг - гибридизация праймеров с матрицей при плавном понижении Т (40-60 °C, 5-60сек) Элонгация - синтез комплементарной последовательности нуклеотидов (72-74 °C, время зависит от длины продукта) Инкубация после завершения всех циклов

• 
  Слайд 35
  

  Денатурация при 94—96 °C Отжиг при 68 °C (например) Элонгация при 72 °C (P=полимераза) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается

• 
  Слайд 36

  Виды ПЦР

  Количественная ПЦР или ПЦР в реальном времени (Q-PCR, RT-PCR) «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) Мультипраймернаяполимеразная цепная реакция ПЦР (multiplex PCR, multiprimer PCR) Заякоренная ПЦР ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) Ассиметричная ПЦР (Asymmetric PCR) Touchdown (Stepdown) ПЦР Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, Polony - PCR Colony) RAPD PCR (RandomAmplification of Polymorphic DNA PCR)ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК ПЦР с использованием горячего старта (Hot-startPCR)

• 
  Слайд 37

  Real time-PCR

  Регистрируется количественное накопление продукта в реальном времени, т.е. после каждого цикла Т.о. можно оценить кинетику реакции Для этого исп-я специфические комп-ты: - флуоресцентный интеркалирующий краситель (SYBR-green) - гибридизационные зонды (метод «TaqMan»)- добавляют олигонуклеотидный зонд, меченный по 5'-концу флюорофором и содержащий глушитель флуоресценции, в ходе реакции термостабильная Taq-полимераза вытесняет зонд из дуплекса, а затем отщепляет его 5'-концевой нуклеотид, меченный флуорофором (светится, если отделен от глушителя)

• 
  Слайд 38
  
• 
  Слайд 39

  «Вложенная» ПЦР (Nested PCR)

  Исп-т 2 пары праймеров для уменьшения кол-ва побочных продуктов Вторая пара амплифицируетуч-к ДНК внутри первой пары

• 
  Слайд 40
  
• 
  Слайд 41

  «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR)

  Дает возм-тьамплифицироватьуч-ки ДНК, фланкирующие область с известной последовательностью Праймеры ориентированы 3’-концами наружу

• 
  Слайд 42

  ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR)

  Метод заключается в последовательном сочетании обратной транскрипции (синтез одноцепочечной ДНК на матрице РНК) и полимеразной цепной реакции Этим методом часто определяют экспрессию генов

• 
  Слайд 43
  

  Мультипраймерная полимеразная цепная реакция ПЦР (multiplex PCR, multiprimer PCR)

  Одновременно используют более одной пары олигонуклеотидныхпраймеров, что приводит к коамплификации нескольких ДНК-матриц Такая реакция позволяет экономить время, она широко используется для экспресс-идентификации инфекционных агентов, напр. скрининга сразу по нескольким инфекционным возбудителям, или для исследования состояния нескольких аллельных генов у эукариотических организмов

• 
  Слайд 44

  Заякоренная ПЦР

  Исп-т если в молекуле НК известна последовательность лишь для одного из праймеров (н-р в случае РНК, легко определить 3’-конец) Принцип: РНКДНК, к 3’-концу которой присоединяют поли(dG)-блок с пом-ю терминальной трансферазы Амплификацию проводят при участии «заякореннго» праймера, сод-го поли(dC)-послед-ть, и специфичного праймера

• 
  Слайд 45

  ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR)

  Модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований) Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это Pfuполимераза Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой

• 
  Слайд 46

  Ассиметричная ПЦР (Asymmetric PCR)

  Вариант ПЦР, при котором концентрация одного из двух праймеров очень низка, и он быстро истощается в ходе реакции С этого момента синтез ДНК продолжается с одного праймера и нарабатываются одноцепочечныефрагменыДНК Проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК Используется в некоторых методиках секвенирования ДНК и гибридизационного анализа

• 
  Слайд 47

  Touchdown (Stepdown) ПЦР

  С помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной Это делается для того, чтобы праймергибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью.

• 
  Слайд 48
  

  Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. ПЦР с использованием горячего старта (Hot-startPCR) — вариант полимеразной цепной реакции для предотвращения неспецифической амплификации фрагментов ДНК (в одном из вариантов метода для этой цели первоначально ДНК-полимеразу и реакционную смесь разделяют легкоплавким физическим барьером (напр., воском); при нагревании пробирки переход ДНК-полимеразы в реакционную смесь происходит при температуре около 55 °С)

• 
  Слайд 49

  Методы ПЦР применительно к генотипированию HLA

  SSO (sequencespecificoligonucleotide) — неспецифическая амплификация исследуемого участка (локуса) ДНК с последующей специфической гибридизацией с мечеными ДНК-зондами. RFLP (restrictionfragmentlengthpolymorphism) — неспецифическая амплификация с последующим расщеплением продуктов амплификации набором рестриктаз. По длине полученных продуктов судят о нуклеотидном составе. SSCP (single-strandconformationpolymorphism) — различие аллелей по электрофоретической подвижности одноцепочечных ДНК, обусловленной характерными элементами вторичной структуры. SSP (sequencespecificprimer) — наиболее распространенная и технически простая методика, когда каждому аллельному варианту либо группе аллелей соответствует своя пара праймеров. MSSP (mixtureofsequencespecificprimer, новый вариант SSP) — позволяющая за счет более рационального выбора праймеров и режимов амплификации выявить сразу несколько специфичностей, используя одну пробирку и одну дорожку на геле. Длительность определения — около часа.

• 
  Слайд 50

  Детекция

  Гель-электрофорез Дот-блот-гибридизация Блот-гибридизация по Саузерну Секвенирование Олигонуклеотидные зонды Чаще всего используется самый простой метод – гель-электрофорез в агарозном или ПАА гелях окрашенных бромистым этидием. Специфичность полосы подтверждается ее положением по отношению к маркерным фрагментам ДНК.