Содержание
-
"Значение и возможности современных молекулярных методов в cистематике и флорогенетике «Молекулярная филогенетика»
-
Молекулярная филогенетика
Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution Theodosius Dobzhansky (1900-1975) Это область биологической систематики, которая занимается идентификацией и прояснением эволюционных взаимоотношений среди разных видов жизни на Земле, как современных, так и вымерших с помощью молекулярно-генетических методов.
-
Возможности и ограничения в использовании молекулярных методов в систематике При выполнении определенных условий, с помощью молекулярных методов можно решать практически любые таксономические и биогеографические вопросы! Необходимые условия: 1 - Корректно поставленная проблема 2 - Выбор подходящего метода для каждой конкретной задачи 3 - Правильный подбор образцов для анализа 4 - Использование для анализа только достоверного материала Выполнение этих условий, без знания объекта (в нашем случае растений), невозможно. Нужно всегда помнить, что молекулярные методы не заменяют классических методов систематики, а только дополняют их!
-
Эволюция является процессом двух фаз, в котором генетическая изменчивостьпервоначально накапливается произвольно, после чего морфологические или физиологические изменения часто подвержены давлению окружающей среды или селективному отбору (Mayr, 1969). За последние 15 - 20 лет разработано большое количестводоступных молекулярных методов, позволяющих решать любые таксономические и биогеографические проблемы. До недавнего времени систематика растений базировалась в основном на данных второй фазы эволюционного процесса,подверженных давлению со стороны, данные молекулярных методовпозволяют реконструировать эволюционный процесс на первичныхпризнаках. Объектом исследованиябольшинства молекулярных методов является макромолекула ДНК. Сама природа ДНК позволяет использовать его как “документ” эволюционной истории.
-
Способность ДНК денатурировать, ренатурировать, а также самоудваиваться, является основой практически для всех методов в молекулярной биологии ДНК – макромолекула обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота
-
Геном растений ГЕНОМ РАСТЕНИЙ - Ядро - Хлоропласты - Митохондрии Митохондрии Ядро Хлоропласты Геном растений включает в себя все типы ДНК присутствующие в организме (клетке) растений
-
Величина генома у различных живых организмах Покрытосеменные Голосеменные Млекопитающиеся Рептилии Птицы Рыбы Членистоногие Кольчатые черви Нематоды Мягкотелые Иглокожие Кищечнополостные Одноклеточные Водоросли Грибы
-
ГЕНОМ РАСТЕНИЙ Ядро – самая крупная часть растительного генома – кодирует большинство белков – содержит большое количество повторной ДНК (=> Большоe различие в количестве ДНК между видами) – показывает рекомбинацию и расшепление признаков поМенделю Arabidopsis thaliana 2n=10 115 million base pairs Allium cepa 2n=16 15300 million base pairs
-
ГЕНОМ РАСТЕНИЙ Хлоропласты – упрощенный геном цианобактерий – кольцевая – от 130 до 160 кб – стабильная структура – эволюционирует очень медленно – наследуется только по материнской линии, рекомбинации очень редки
-
ГЕНОМ РАСТЕНИЙ – упрощенный геном бактерий – кольцевая – от 200 до 2000 кб – частые рекомбинации – структура нестабильная – наследуется по материнской линии – Гены эволюционируют очень медленно Митохондрии
-
Выделение ДНК из растений Экстракция чистой недеградированной ДНК из растительных объектов остается определяющим первым этапом в любой сфере использования молекулярно-генетических подходов для изучения растительных организмов. Особенности выделения ДНК из растений! При экстракции ДНК из растительных объектов необходимо не только дезактивировать клеточные ферменты, но и «удалить» запасные вещества, например, полисахариды и вторичные метаболиты, такие как алкалоиды, фенольные соединения, терпены, которые не просто мешают изолированию ДНК, но и отрицательно влияют на ее качество. Процедура выделения ДНК включает обязательные процедуры: - разрушение клеток; - удаление мембранных липидов; - удаление вторичных метаболитов и запасных веществ; - удаление белков; - удаление РНК; - осаждение ДНК. Разработано огромное количество протоколов для выделения ДНК. Комерческими компаниями предлагаются множество КИТов для выделения ДНК из растений, основанных на силиконовых мембранах, стоимость выделения одной пробы которыми колеблется от 1 до 6 Евро Колонка с силиконовой мембраной
-
Из каких частей (органов) растений лучше всего выделять ДНК? Лучше всего выделять ДНК из молодых органов растений (молодые листья, соцветия и т.д.). В них меньше всего запасных веществ и вторичных метаболитов. Но к сожалению это не всегда доступно! Чаще всего для таксономических работ мы имеем дело со специально собранными образцами или с гербарным материалом. Кроме того растения сильно различаются по компонентному составу вторичных метаболитов. Поэтому для каждой группы растений иногда приходиться модифицировать протоколы выделения ДНК (например: суккулентные растения; хвойные). При работе с Гербарным материалом особо важное значение имеет, как был высушен гербарий. Чем естественей цвет растения в гербарии, тем больше вероятность в получении рабочей, мало деградированной ДНК. Сбор материала в поле и т.д.: Наилучший результат при сборе материала получают при высушивании проб в силикагеле. Ваучер! В таксономических исследованиях к любым публикуемым последовательностям ДНК неоходимо указание на Гербарный образец с которого выделена ДНК (vouchered specimen).
-
Набор для выделения ДНК из засушенных растений и семян DiamondDNA Genomic DNA Extraction Kit for Dry Plants & Seeds http://diamond-dna.ru
-
Если метод анализа маркера позволяет выявлять оба аллеля, говорят о кодоминантном типе наследования данного маркера, если выявляется только один аллель – о доминантном наследовании Маркерные системы ДНК (Молекулярные маркеры) Молекулярные маркеры представляют собой генетические маркеры, позволяющие анализировать организм на уровне ДНК. К ним применимы термины классической генетики, такие как локус, аллель, доминантный и кодоминантный тип наследования. Аллели маркерных локусов представляют собой различные формы (нуклеотидные последовательности, отличающиеся по длине и/или по нуклеотидным заменам) одного и того же маркера, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом. ДНК маркеры условно можно разделить на три группы: маркеры, основанные на гибридизации, маркеры, основанные на ПЦР и маркеры, основанные на ДНК-чипах.
-
ПЦР очень мощный метод размножения фрагментов ДНК вне организмов (in vitro). С момента его открытия в 1985 году, этот метод используется сейчас практически во всех молекулярно-биологических лабораториях. В 1980 году Каледин с сотрудниками впервые выделили и описали свойства днк-полимеразы из термофильной бактерии Thermus aquaticus. В 1985, технология полимерной цепной реакции (PCR) была введена Миллисом (Mullis) c сотрудниками. PCR - polimerase chain reaction Полимеразная цепная реакция - ПЦР „Baby Blue“ Thermocycler, 1986. Полимеразная цепная реакция - ПЦР Денатурация 95°C Отжиг 52°-68° C Элонгация 72° C
-
ДНК маркеры основанные на ПЦР, также условно делятся на две группы: Методы фрагментного анализа ДНК. Анализ последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК (секвенирование).
-
Молекулярные методы исследования ДНК растений, базирующиеся на фрагментном (анонимном) полиморфизме ДНК: RFLP, RAPD, AFLP, ISSR, микросателлиты, SCоT и другие....
-
Маркеры различных последовательностей ДНК, отношение которых к структурным генам, как правило, неизвестно Молекулярные маркеры представляют собой генетические маркеры, позволяющие анализировать организм на уровне ДНК. К ним применимы термины классической генетики, такие как локус, аллель, доминантный и кодоминантный тип наследования. Аллели маркерных локусов представляют собой различные формы (нуклеотидные последовательности, отличающиеся по длине и/или по нуклеотидным заменам) одного и того же маркера, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом. Если метод анализа маркера позволяет выявлять оба аллеля, говорят о кодоминантном типе наследования данного маркера, если выявляется только один аллель – о доминантном наследовании
-
RFLP PCR Restrictions Fragment Length Polymorphism Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) Рестрикционный фермент Это способ исследования ДНК, путем разрезания амплифицированных фрагментов с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза (ДНК электрофореза). A B A B М А В Часто использовался для анализа хлоропластной ДНК
-
RAPD анализ включает в себя проведение полимеразной цепной реакции с использованием одного декануклеотидного праймера с произвольной нуклеотидной последовательностью. Продукты RAPD анализа образуется в результате амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкированного инвертированной последовательностью данного праймера. Метод: RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA Cлучайно амплифицируемая полиморфная ДНК (Williams et al, 1990). A B М А В
-
Для повышения достоверности необходимо использование большого количества ПЦР реакций с различтыми праймерами Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных. Плюсы и минусы RAPD Метода: Доминантный маркер + Сравнительно быстрый и дещевый метод - Высокая чувствительность к изменениям условий реакций – сравнивать можно только фрагменты амплификации из одной ПЦР реакции - ограниченное количество образцов в каждом анализе RAPD анализ может служить своеобразным экспресс - методом выявления генетического полиморфизма, что особенно актуально для малоизученных таксономических групп,
-
AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP маркеры – маркеры полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (Vos et al., 1995). 4 - Во второй ПЦР праймеры с адаптерами EcoRI и MseI содержат на 3’ – конце дополнительные и некомплементарные адаптерам основания (от 1 до 3) для селективной амплификации. 1 - Геномная ДНК рестрицируется двумя рестриктазами (EcoRI и MseI) с образованием фрагментов с выступающими 3’ – концами. 2 - Рестрицированная геномная ДНК легируется с адаптером, содержащим «липкие» концы для данных рестрикционных сайтов. Далее проводятся две последовательные ПЦР: 3 - В первой ПЦР используются праймеры полностью комплементарные адаптерам EcoRI и MseI, в результате чего образуется большое количество продуктов амплификации между адаптерами EcoRI и MseI, которые невозможно дифференцировать с помощью электрофореза. 1 2 3 4 EcoRI MseI
-
AFLP-Акриламидный Гель 3 AFLP-Реакции и один Стандарт (Красный) Разделение фрагментов ДНК проводят в полиакриламидном геле с радиоктивной или с флуорисцентной меткой. AFLP
-
Плюсы и минусы AFLPМетода: Доминантный маркер + Полиморфизм AFLPвыше чем у RAPD и ISSR. + неограниченное количество образцов в каждом анализе - Сравнительно дорогое оборудование, програмное обеспечение и также дорогие расходные материалы.
-
ISSR — Inter Simple Sequence Repeats (Zietkiewicz et al, 1994). ISSR маркеры – маркеры основанные на межмикросателитных последовательностях При ISSR анализе также как и в RAPD используется один или несколько праймеров длиной 15-24 нуклеотида. Праймеры комплементарны повторяющимся участкам генома, таким как микросателлиты. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями. Микросателлитная ДНК – ДНК из коротких тандемных повторов длиной от 1 до 6 пар оснований. Используются как молекулярные маркеры в определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации. Пример ISSR праймера 5‘-CACACACACACACACAG-3‘
-
Плюсы и минусы ISSR Метода: Доминантный маркер + Сравнительно быстрый и дешевый метод Относительно высокая точность и улучшенная воспроизводимость по сравнению с RAPD в связи с большей длиной праймера и более высокой температурой отжига. - Однако локализация в геноме продуктов амплификации, так же как и функция, остаются неизвестными
-
Simple SequenceRepeats (SSRs) Микросателиты ПЦР с флангирующими праймерами к короткому мини или микросателитному повтору позволяет выявлять маркеры с кодоминантным наследованием и, соответственно, удобен для выявления гетерозигот по данному локусу. Однако, одна пара праймеров для флангов в ПЦР позволяет рассматривать полиморфизм только одного локуса. Для многих микросателлитных локусов не удается выявить полиморфизм. Как правило, фланкирующие последовательности для данного микросателлитного локуса оказываются видоспецифичными.
-
- универсальность метода в использовании - высокая степень полиморфизма - возможность делать внутривидовые филогенетические построения, в том числе изучать малые, изолированные и однополые популяции - ограничение: участие в рекомбинационном процессе, трудно сравнивать далекие в систематическом отношении организмы SSR - Simple SequenceRepeats Кодоминантный маркер
-
Сравнение SSR и ISSR В SSR методе работают два фланкирующих праймера одного микросателитного региона, а в ISSR методе работает один праймер, содержащий повторы и амплифицирует регион между микросателитами.
-
SCoT - Start Codon Targeted PolymorphismCollard, B. C. Y. & Mackill, D. J. 2009 18-mer SCoT primers 1 CAACAATGGCTACCACCA 50 2 CAACAATGGCTACCACCC 56 3 CAACAATGGCTACCACCG 56 4 CAACAATGGCTACCACCT 50 5 CAACAATGGCTACCACGA 50 6 CAACAATGGCTACCACGC 56 7 CAACAATGGCTACCACGG 56 8 CAACAATGGCTACCACGT 50 9 CAACAATGGCTACCAGCA 50 10 CAACAATGGCTACCAGCC 56 11 AAGCAATGGCTACCACCA 50 12 ACGACATGGCGACCAACG 61 13 ACGACATGGCGACCATCG 61 14 ACGACATGGCGACCACGC 67 15 ACGACATGGCGACCGCGA 67 16 ACCATGGCTACCACCGAC 56 17 ACCATGGCTACCACCGAG 61 18 ACCATGGCTACCACCGCC 67 19 ACCATGGCTACCACCGGC 67 20 ACCATGGCTACCACCGCG 67 21 ACGACATGGCGACCCACA 61 22 AACCATGGCTACCACCAC 56 23 CACCATGGCTACCACCAG 61 24 CACCATGGCTACCACCAT 56 25 ACCATGGCTACCACCGGG 67 26 ACCATGGCTACCACCGTC 61 27 ACCATGGCTACCACCGTG 61 28 CCATGGCTACCACCGCCA 67 29 CCATGGCTACCACCGGCC 72 30 CCATGGCTACCACCGGCG 72 31 CCATGGCTACCACCGCCT 67 32 CCATGGCTACCACCGCAC 67 33 CCATGGCTACCACCGCAG 67 34 ACCATGGCTACCACCGCA 61 35 CATGGCTACCACCGGCCC 72 36 GCAACAATGGCTACCACC 56 Gene A 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ Gene B SCoT primer SCoT primer Genotype 1 Gene A 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ SCoT primer Genotype 1 Present Absent Относительно новый метод основанный на полиморфизме фланкируемый с коротким консервативным ATG старткодоном. Для ПЦР используется 18 нуклеотидный праймер, включающий ATG. Collard, B. C. Y. & Mackill, D. J. 2009: Start Codon Targeted (SCoT) Polymorphism: a simple novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants.- Plant Molecular Biology Reporter 27: 86-93.
-
1 2 3 4 5 6 8 Apium graveolens 9 Apium inundatum 7 Start Codon Targeted (SCoT) Polymorphism 1-9 Популяции Apium repens из Германии и Австрии Primer: SCoT16 Полиморфизм популяций Apium repens
-
LTR- long terminal repeat; Gag - core particle components; rt - reverse transcriptase; int - integrase; env - envelope glycoprotein. LTR-Retrotransposons LTR- Ретротранспозоны Ретротранспозоны широко распространены у растений и могут составлять до 50 % всей геномной ДНК
-
1. Перевод наличие или отсутствие одинаковых фрагментов ДНК в бинарную матрицу (есть / нет полосы) a. Анализ геля на наличие полос вручную или при помощи программ Программы : Phoretix 1D Professional GeneMapper Программы бесплатные: CrossChecker (http://www.plantbreeding.wur.nl/UK/software_crosschecker.html) В любом случае проверка вручную на адекватность интерпретации ! Обработка и анализ данных фрагментного анализа
-
Пример бинарной матрицы фрагментного метода для кластерного анализа М 1 2 3 4
-
Обработка данных фрагментного анализа 2. Анализ сходства и построение деревьев а. Создать матрицу попарных расстояний б. Провести кластеризацию одним из имеющихся многочисленных методов ( UPGMA, NJ и т.п.) Расстояния: коэффициенты по парного сходства ( S ) между фингерпринтами отдельно по каждому праймеру по формуле: S=2Fab( Fa+Fb ), где Fab - число полос, общих для двух особей, Fa и Fb –общее число полос для каждой особи.
-
Обработка микросателлитных последовательностей Перевод в частоты аллелей Проверки на соответствие распределение Харди - Вайнберга Подсчет многочисленными программами для популяционной генетики (BioSys, Arlequine, GenePop и многие другие )
-
DNA-Сиквенс RFLP Микросателиты SCAR AFLP RAPD / SCoT/ Методы Области применения маркерных систем /молекулярных методов/ на различных таксономических уровнях Spacer/Introns Gene cpDNA Организм Популяция Подвид Вид Секция Род Семейство Порядок Класс SNP
-
"RAPD-Analyse у Allium ramosum и A.tuberosum 1 8L 18 0 0582 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 2499 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 2014 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2755 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 2371 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1695 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2339 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 3643 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
-
ДНК Таксономия и современные методы изучения последовательностей ДНК (секвенирование).
-
ДНА секвенировани для нужд филогеники Амплификация определенного фрагмента днк у сравнимых таксонов. Проведение реакции секвенирования всех амплифицированных фрагментов. Прочтение амплифицированных фрагментов на секвенаторе. Составление алаймента. Анализ последовательностей и построение филогенетических деревьев
-
DNA-Сиквенс RFLP Микросателиты SCAR AFLP RAPD / SCoT/ Методы Области применения маркерных систем /молекулярных методов/ на различных таксономических уровнях Spacer/Introns Gene cpDNA-mnDNA Организм Популяция Подвид Вид Секция Род Семейство Порядок Класс SNP SNP-Retrotransposons
-
Найболее популярные фрагменты ДНК используемые в филогенетике растений ITS – internal transribed spacer of ribosomale DNA –внутригенный спейсор рибосомальной ДНК Гены, интроны и межгенные спейсоры хлоропластной ДНК
-
ITS 1 ITS 2 5,8S 26S 18S IGS Около 700 пар нуклеотидов Транскрипция Повтор ETS 18S ETS Схематичная диаграмма повтороврибосомальной ДНК у растений. 18S, 5,8S, and 26S refer to the ribosomal rDNA genes IST-1 and IST-2 are the two internal transcribed spacer regions; ETS is the external transcribed spacer
-
>Am261_nigrum AATCGTCTAGATGTAGATTCTAGAATCCGATTTAGAATGGATGAATAAAGGTTCTTTTAAACTCTTTTGTTTAAACTAAAGTATTCTTTGAATTTTTAATAACACTTAGAAAGATATTTTTTTTTATAAAAAAAATATATATAAATTAAATAAATAGGATTTTATACATATCAAAATGTAATTACTAAATTTAATAAATGAAATTAGAAATTTAAAGACTCTTTTTCTAAAAATCTTGTTTTTAGTCTACTTTTAAATGTACTTAGTGTAATTTTATTAATTATTCTAAGTTATATAGAAAATATATATATATATAATTAATAATTAATTAAGTTATAATTAATTAAGTATATAATATATATATACTCTTTGTTGTTTGTTATGTATATAATTTAAATATAGGATAATATTTAGTAAACAAAACCAATTTAATTTGATCTTGAGATATACATATAATAAAACAAAACAGTTTGAATATTCATCATAATTGCATTTTATTTCTTTTCCTAATGGAAAAGAAATAAAATAATACTTAGAACCAAACTAGCAGACAGATAAGTTAGTATTCGACATAAAATAGCAGCGAGTTCTAATTAATCTTGAGGAGGTCAATACATAAGGTAATAAAAATTTTCCATATTCTAAATATAGAAAAGTTCTTTAAATCCCGGAATTCMAATTATTCCAAGGTTTTCTTATTTGTTTGGCGCACAAAAAAACTTTTAGAATTTCCCCGTAGAAAACTGGCTTTGGTAAAGAAAAGGCTTTTATTGCAACTAAATTTCCCTTTTTCTTCC >Am262_victorialis AATCGTCTAGATGTAGATTCTAGAATCCGATATAGTTATACTTTAGGAAACATTAGAATGGATGAATAAAGGTTCTTTTAAACTCGTTTGTTTAAACTAAAGTATTCTTTGAATTTTTAATAACACTTAGAAAACTTAGAACGATATTTTTTTTTATCAAAAATAAATATAAATTAAATAAATAGGATTTTATACATATCAAAATGTAATTACTAAATTTAATAAATTAAATTAGAAATTAAAAGACTCTTTTTCTAAAAATCTTGTTTTTAGTCTACTTTTTAATGTACTTAGTATAATTTTATTAATTATTCTAATTATATAGAAAATATATATATAATTAATTAATTATATAATATATATATACTCTTTGTTGTTTGTTATGTACATAATTTAAATATAGGATAATATTTAGAAAACAAAACCAATTTAATTTGATCTTGAGATATACATATAATAAAACAAAACAGTTTTAATATTCATCATAATTGCATTTTATTTCTTTTCCTAATGGAAAAAAAATTTTCTACTGAGAAAAGAAATAAAATAATACTTAGAACCAAACTAGCAGACAGATAAGTTAGTATTCGACATAAAATAGCAGCGAGTTCTAACAAATCTTGAGGAGGTCAATACATAAGTTAATGAAAATTTTTCATATTCTAAATATAGAAAAATTCTTTAAATCACGGAATTCAAATTATTCCAAGATTTTCTTATTTGTTTGCTGCACAAAAAAACTTTTTGAATTTCCTGTAGAAACTGACTTTGCTAAAGAAAAGGCTTTTATTGCAACTAAATTTCCCTTTTTCTTCC >Am264_wallichii AATCGTCTAGATGTAGATTCTAGAATCCGATCTAGTTATACTTTAGTAAACATTAGAATAGATTAATAAGGGTTCCTTTCAACTCTTTTGTTTAATTTAAACTAAAGTATTCTTTAAATTGTTAATAACACTTATAAAACTTAGAAAAATATTTTTTTTTATTAAAATAAATATAAATTCGATAAATAGGATTTTATACATATCAAAATGAAATTAGAAATTAAAGGACTCTTTTTCGAAAAATCTTGTTTTTAGTCTACTTTTTTTAATGTACTTAATGTAATTTCATTAATTATTCGAATTCTATAAATATAGAAAATAGAAAATATATATAATGTTAATTAATTATATAAAAAATATATATATATTTTTTTTATATACTCTTTGTTGTTTGTTATGTACATAATTTTAATATAGGATAATATTTAGTAAAGGGAACCAATTTAATTTGATCTTCAGATAGACATATAATAATAATAAAACAAAATAGTTTTAATATTCATCATAATTTCATTTTATTTCTTTTCCTAATGGAAAAAATCCTAATGGAAAAAAATATTTTTCTACTGGGAAAAGAAATAAAATAATACTTAGAACCAAACTAGTAGACAGATAAGTTAGTATTCGACATAAAATAGCAGCGAGTTCTAACTAATCTTGAGGAGGTCAATACATAAGTTAATGCAAATTTTTCATATTCTAAATATAGAAAAGTTCTTTAAATCACAGAATTCAAATTATTCCAAGATTTTCTTATTTGTTTGCCGCACAAAAAAACTTTTTGAATTTCCCGTAGAAACGGACTTTGCTAAAGAAAAGGCTTTTATTGCAACTAAATTTCCCCTTTTCTTCC >Am263_insubricum GATCGCAGATGGGATTCAGAATCCGTATAGTTATACTTAGGAAACATTAGAATAGATGAATAAGGGTTCCTTTCAACTCTTTTGGTTAATTTAAACTAAAGTATTCTTTAAATTGTTAATAACACTTATAAAACTTAGAAAGATATTTCTTTAAATTCAAAGAAATATAAATTCAATAAATAGGATTTTATACCCNATCAAAATGTAATTACTAAATTTCATAARTGAAATTCGAAATTAAAGGACTCTTTTTCTAAAAATCTTGTTTTTAGTCTACTTTTTAATGTACTTAATGTAATTTCATGAATTATTATTTCATTAATTATTCTAATTATATAAATATAGAAAATATATATAATGTTAATTAATTATATAAAATATATATATTCTTTGTTTATATACTCTTTGTTGTTTGTTATGTACATAATTTAAATATAGGATAATATTTAGTAAACGAAACCCATTTTATTTGATCTTCAGATAGACATATAATAAAACAAAATAGTTTTAATATTCATCATAATTACATTTTTTTTCTTTTCCTAATAGAAAAAAATATTTTTCTACTGGGAAAAGRAAAAAAATTAATACTTAGAACCAAACTAGTAGACAGATAAGTTAGTATTCGACATAAAATAGCAACTTAGTTCTAACTAATCTTGAGGAGGTCAATACATAAGTTAATGCAAATTTTTCATATTCTAAATATAGAAAAGTTCTTTAAATCACGGAATTCAAATTATTCCAAGATTTTATTATTTGTTTGCCGCACAAAAAAACTTTTTGAATTTCCCGTAGAAACTGACTTGCAAAGAAAAGGCTTTTATG >Am277_oreoprason AATCGTCTAGATGTAGATTCTAGAATCCGATATAGTTATACTTTAGGAAACATTAGAATGGATGAATAAGGGTTCTTTTAAACTCTTTTGTTTAAAATAAAGTATTCTTTGCATTTTTAATAACAATTAGAAAACTTAGAAAGATCTTTTTTATCAAAAATAAATATATTTATCAAAAATAAATATAAATTAAATAAATAGGATTTTTTACATATAAAAATGTAATTACTAAATTTAATAAATTAAATTAGAAATTCAAAGACTCTTTTTCTAAAAATCTTGTTTTTAGTCTACTTTTTAATGTACTTAGTGTAATTTAATTAATTATTCTAATTATATAGAAAATATATATACTTTTTGTTGTTTGTTATGTACATAATTTAAATATAGGATAATATTTAGTAAACAAAACCAATTTTATTTGATCTTGAGATAGACATATAATAAAACAAAACAGTTTTAATATTCATCATAATTGCATTTTATTTCTTTTCCTAATGGAAAAAAATTTTTCTACTGGGAAAAGAAATAAAATAATACTTAGACCCAAACTAGCAAACAGATAAGTTAGTATTCGACATAAAATAGTAGCTTGTTCTAACTAATCTTGAAGAGGTCAATAAATACATAAGTTAATGAAAATTTTTCATATTCTATATATAGAAAAGTTCTTTAAATCAAAATCACGGAATTCAAATTATTCCAAGATTTTCTTATTTGTTTGCCGCACAAAAAAACTTTTTGAATTTCCCGTAGAAACTGACTTTGCTAAGGAAAAGGCTTTTATTGCAACTAAATTTCCCTTTTTCTTCC >Am270_tuvinicum AATCGTCTAGATGTAGATTCTAGAATCCGATATAGTTATCCTTTAGGAAATGGATGAATAAGGGTTCTTTTAAACTCTTTTGTTTAAACTAAAGTATTCTTTTTATTTTTAATAACACTTAGAAAACTTAGAAAGATCTTTTTTATCAAAAAAAAAGAAATATAAATTAAATAAATAGGATGATTTTATACATATCAAAATATAATTACTAATTTTAATAAATTAAATTAGAAATAAAAAGACTCGTTTTCTAAAAATAAAAATCTTGTTTTTAGTCTACTTTTTAATGTATTTAGTGTAATTTAATTAATTATTCTAATTATATAGTGATTATATAGAAAATATATATATATATATATAATAATTATATTAATATTTGTTGTTTGTTATGTACATAATTTAAATATAGAATNATAATTAGTAANCAAAACAAATTTCATTTGATCTTGAGATAGACATATAATAAAACAGTTTTAATATTCATTATAATTACATTTTATTTCTTTTCCTAATGGAAAAAAATTTCTACTGGGAAAAGAAATAAAATAATACTTAGAACCAAACTAGCAGACAGATAAGTTAATATTCGACATAAAATAGCTGCTAGTTCTAACTAATCTTGAGGAGGTAAATAAATACAAAAGTTAATGAAAAATTTTCCTATTCTATATATGGAAAAGTTCTTTAAATCACGGAATTCAAATTATTCCAAGATTTTCTTATTTGTTTGCCGAACAAAAAAACTTTTTGAATTTCTCGTAGAAACTGACTTTGCTAAAGAAAAGGCTTTTATTGCAACCAAATTTCCTTTTTTCTTCC >Am278_eduardii AATCGTCTAGATGTAGATTCTAGAATCCGATATAGTTATCCTTTAGGAAATGGATGAATAAGGGTTCTTTTAAACTCTTTTGTTTAAACTAAAGTATTCTTTTTATTTTTAATAACACTTAGAAAACTTAGAAAGATCTTTTTTATCAAAAAAAAAAAAAGAAATATAANTTAAATAAATAGGANGATTTTATACATATCAAAATATAATTACTAAATTTAATAAATTAAATTANAAATTAAAAGACTCGTTTTCTAAAAATAAAAATCTTGTTTTTAGTCTACTTTTTAATGTATTTAGTGTAATTTAATTAATTATTCTAATTATATAGTGATTATATAGAAAATATATATATATAATAATTATATTAATATTTGTTGTTTGTTATGTACATAATTTAAATATAGAATAATAATTAGTAAACAAAACAAATTTCATTTGATCTTGAGATAGACATATAATAAAACAGTTTTAATATTCATTATAATTACATTTTATTTCTTTTCCTAATGGAAAAAAATTTCTACTGGGAAAAGAAATAAAATAATACTTAGAACCAAACTAGCAGACAGATAAGTTAATATTCGACATAAAATAGCTGCTAGTTCTAACTAATCTTGAGGAGGTAAATAAATACATAAGTTAATGAAAAATTTTCATATTCTATATATAGAAAAGTTCTTTAAATCACGGAATTCAAATTATTCCAAGATTTTCTTATTTGTTTGTCGAACAAAAAAACTTTTTGAATTTCTCGTAGAAACTGACTTTGCTAAAGAAAAGGCTTTTATTGCAACTAAATTTCCCTTTTTCTTCC
-
Дидезокси метод секвенсирования ДНК по Заeгеру Sanger F. et al. (1977): Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA. In: Nature. Bd. 265, S. 687–695 Frederic Sanger
-
Флуоресцентные метки и автоматизированное чтение геномов До1000 бп за одно прочтение 96-capillary ABI 3730XL
-
Современные методы секвенирования второго и третьего поколения Next-generation DNA sequencingNGS the Roche/454FLX Pyrosequencer (http://www.454.com/enabling-technology/the-system.asp) the Illumina/Solexa Genome Analyzer (7) (http://www.llumina.com/pages.ilmn?ID=203) Applied Biosystems SOLiDTMSystem (http://marketing.appliedbiosystems.com/images/Product / SolidKnowledge / flash /102207/solid.html). Helicos HeliscopeTM(www.helicosbio.com) Pacific Biosciences SMRT (www.pacificbiosciences.com) instruments. И многие другие ........ Анонсированы
-
Общий принцип секвенирования нового («второго») поколения
-
Сравнение этапов первого и второго поколения методов секвенирования Shendure1& Hanlee(2008) Nature Biotechnology 26, 1135 - 1145
-
Секвенаторы «нового поколения» — высокопроизводительные секвенаторы ДНК, не использующие метод терминации цепи Сэнгера и капиллярный электрофорез. Принципы работы приборов различаются от производителя к производителю. Производительность таких секвенаторов на несколько порядков превосходит производительность самых мощных капиллярных приборов и достигает сотен млрд. пар оснований за запуск
-
Технологии секвенирования второго поколения: Illumina (Solexa)
-
Технологии секвенирования второго поколения: Applied Biosystems SOLiD
-
Длина прочтения одного фрагмента 454-FLX Titanium Illumina HiSeq SOLiD 5500 240–400- 700 2x100 2 x 50 Количество прочтенных фрагментов за одну реакцию 500 тысяч 2 миллиарда 2 миллиарда Сравнение производительности секвенаторов второго поколения
-
Новые горизонты и ограничения в применении секвенирования второго и третьего поколения в систематике и филогенетике Секвенирование хлоропластного Генома любых видов (наличие реферативной последовательности ) Снип метод Довольно быстрое определения Микросателитных примеров И многое другое ....... Чтобы «собрать» геномную последовательность из нескольких миллиардов коротких отсеквенированных фрагментов, необходимы очень мощные компьютеры и также наличие реферативного (уже) отсеквенированного ранее близкородственного генома. Для дикорастущих видов растений с большим геномом это практически еще проблематично.
-
Отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T, G или C) в геноме (или в другой сравниваемой последовательности) представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом. Если две последовательности ДНК — AAGCCTA и AAGCTTA — отличаются на один нуклеотид, в таком случае говорят о существовании двух аллелей: C и T. SNP возникают в результате точечных мутаций. Single nucleotide polymorphism, SNP Однонуклеотидный полиморфизм (ОНП или снип)
-
DNA Тaxonomy andBarcoding
-
Три важнейших задачи Таксономии 1. Опредление и описание новых видов. Названия видов – это основа для любых флористических списков 2. Классификация Выяснение таксономического статуса и номенклатуры 3. Создание алгоритмов (пособий) для определение видов (Определители и Флоры; Ключи для видов, родов и т. д........ • Определение видов это достаточно трудоемкий и сложный процесс, который часто требует высокой квалификации. • К этому еще дополняется проблемма перепроверки – без сравнительного материала (т. Н. „Vouchers“), любое название растения, независимо от того, где оно опубликовано, в лучщем случае является предположением. Очень важную роль здесь играют Гербарии.
-
Barcoding Возможность определения любого таксона с помощью прочтения одного или двух фрагментов ДНК. Для этого необходимо создание Базы данных с сиквенсами этих фрагментов.
-
ДНК штрих-код (Barcodes) First International Conference for the Barcoding of Life Februar 2005
-
ДНК из растений и других организмов Клонирование ДНК из почвы, из воды в пруду, из озера или реки Секвенсирование MOTU (molekulare Taxa Unit) Филогенетический анализ Сравнение с близкородственными видами PCR Секвенсирование Ваучер в Коллекциях Например в Гербарии ДНК штрихкод (Barcodes) PCR
-
Примеры из практики Ботанического сада Университета Оснабрюк В коллекцииБотатического сада находится целый ряд растений без названия
-
Пример 1 86-09-0064-10 Boraginaceae 1985 из Мексики
-
>nn-Boraginaceae? TGCGAGCCTCGCGAAAACAAACCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAATACCATAGACGAGGGCCTTCCTTTCCCCGCCCCGTCCGCGGAGCGTGGGGCGAGGCAACGGCATCTTCTCGAATGAAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGGACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCGTCAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCTCCCGCACTCCCCGCCCTTCCAGGGTGCATCGGCTAGTGCGCGGGGGCGGATTGTGGCCTCCCGTGCCCTTCGTTCGGCGCGGTTGGCCGAAATACGAGTCCGGGGCGAAGGACGTCRCGACGAGTGGTGGTTGGAACTTTCAACTCTCGTGTTGCCGTGCCGTGTCCTGTTGCTCGACCGAGACTGAGGAGACCCTGACGCGCTTGTCTCGTTCCGACGGGAGGAGCCACGCGCTACGACCGCGACCCCAGGTCAG Пример 2.
-
Cordia sonorae Rose Boraginaceae из 86-09-0064-10
-
Растение под номером 84-00-0313-80 с 1984 года находилось в коллекцииБотатического сада без названия. ITS 1 Пример 2
-
>nn TCGTCGTCACCCGCACTTCGTGGAGTTCGGGAGACGGATGTTGGCCTCCCGTGCCCCTGCGGTGCGGCCGGCCTAAATGCGAGTCCTCGGCTCGGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGAACTCATCAACTCGTTTGCTGTCTTGACGACGCCCGTCGCCGGTGAACGGCTCGATCGACCCGAGAGCCCCGAAAAGGGCCTTCGAAC
-
Coprosma montanum Hillebr. Rubiaceae
-
ДНК Таксономия в ближайшем (и не совсем ) будующем.
-
atpF-atpH spacer, matK gene, rbcL gene, rpoB gene, rpoC1 gene, psbK-psbI spacer, and trnH-psbA spacer A DNA barcode for land plants CBOL Plant Working Group1 PNAS August 4, 2009 vol. 106 no. 31б 12794–12797 rbcL, matK Проанализировано 397 видов растений из всех таксономических групп.
-
Методы филогенетического анализа: процедура выравнивания, филогенетические деревья и методы их построения
-
Задача молекулярной филогенетики состоит в преобразовании информации содержащейся в семантидах (ДНК )в эволюционное дерево.... Для преобразовании информациисодержащейся в ДНК, необходимо подготовить полученные сиквенсы (или данные RAPD, AFLP и др.) для анализа - Матрица или Alingnment
-
AlignmentПроцедура выравнивания
Alignment- это гипотеза о Гомологии между нуклеотидами - Гомология: Сходство это результат Наследства от одного общего предка - установление и сравнение гомологичных признаковэто центральный принцип филогенетического анализа
-
Процесс выравнивания (alignment)подразумевает выстраивание последовательностей наиболее близких к исследуемому объекту видов друг под другом с таким расчетом, чтобы они совпадали как можно более полно, тогда одни консервативные участки будут располагаться под другими.
-
ДНК Алфавит
Все ДНК молекулы состоят из нуклеотидов, которые содержат сахар, фосфатную группу и одну из четырех нуклеидных кислот: Adenin, Cytosin, Guanin и Thymin. Из их начальных букв и состоит алфавит ДНК (A, C, G; T) Однобуквенные сокращения для ДНК алфавита A Adenine B C,G or T C Cytosine D A,G or T T Thymine H A,C or T G Guanine V A,C or G W Weackbonds (A, T) N A,C,T or G S Strong bonds (C, G) R Purines (A, G) Y Pyramidines (C, T) K Keto (T, G) M Amino (A,C)
-
Мутации
Характеризуемые по длине сиквенса a) Точечная мутация (только один нуклеотид) b) длинная мутация (затрагивает 2 или многих соседних нуклеотидов 2) Характеризуемые поспособу замены нуклеотидов a) Substitution (замена одного нуклеотидана другой) b) Inversion (переворот 2 или нескольких нуклеотидов одной части ДНК на 180° ) c) Insertion (вставка одного или нескольких нуклеотидов) d) Deletion (потеря одного или нескольких нуклеотидов) InDels AATTGCATG AAT-GCATG Insertion Deletion AATGCATGAAGATCGG AATGCATGCCTCGATT совпадение (match) несовпадение (mismatch) gap
-
Выравнивание может быть простым или сложным Простое Сложное из-за вставок или делеций (indels)
-
Структупная формула части молекулы хлоропластной ДНК
-
Алгоритмы выравнивания
Искоммый алгоритм должен выбрать выравнивание с наименьшей дистанцией (наибольшим сходством) из всех возможных вариантов. Учитывая, что два сравнительно коротких сиквенса в 300 бп дает 1088 различных вариантов, то анализ всех этих вариантов является не самым экономным путем.
-
Методы выравнивания сиквенсов 3 главных метода: Ручной (Manual) Компьютерный Комбинированный
-
Ручное выравнивание Почему? Может применяться: Выравнивание простое. Имеется дополнительная информация о структуре ДНК Компьютерное выравнивание имеет локальные проблеммы Компьютерное выравнивание можно проверить и откоректировать
-
Каждые две ДНК последовательности выравниваются при помощи Needleman-Wunsch коэфициента сходства Отсюда получают генетические дистанции. На основе генетических дистанций расчитывается NJ-дерево На основе этого модельного дерева составляется множественное выравнивание (multiplesAlignment) ДНК последовательностей. Последовательно составляются вначале из соседних последовательностей в NJ-дереве блоки последовательностей и затем из блоков конструируется полное выравнивание всех последовательностей. ClustalW ПРИНЦИП
-
Филогенетические Деревья – способ графического выражения эволюционных взаимоотношений
-
Элементы филогенетического дерева.
Филогенетическое дерево представляет собой математическую структуру, используемую для моделирования эволюционой истории группыпоследовательностей или организмов. Филогения или эволюционное дерево графически отражают состояние исторических связей Филогенетическое дерево - это практически всегда Гипотеза
-
Терминологияфилогенетического дерева Дерево состоит из узлов (nodes), связаных между собой ветвями (Branches) Терминальные узлы(Terminal nodes)(также именуемые OTU, оперативной таксономической единицей, или терминальным таксоном), представляют собой последовательности (sequences)генов или организмов, по которым мы располагаем данными. Они могут быть вымершими или живущими в настоящее время. Внутренние узлы (Internal nodes) представляют собой гипотетических предков Корень (root) является родоначальником всех последовательностей, составляющих дерево. Клада (clade) - Комплекс видов,которые включают все таксоны происшедшие от одного общего предка.
-
У филогенетических деревьев надо правильно считывать информацию Все три дерева содержат одинаковую топологическую информацию
-
Узлы и Ветви дерева содержат различные типы информации .. От числа ветвей отходящих от внутреннего узла зависит степень разрешения узла: Если узел имеет степень больше, чем 3 (т. е. один предок и два ближайших потомка), это называется политомией(polytomy) Дерево не имеющее политомий считается полностью разрешенным
-
Имеется два типа политомий: Мягкая политомия – является отражением неуверенности. Все линии не обязательно произошли одновременно, но мы не уверены в порядке расхождения. Жесткая политомия – все линии произошли одновременно от одного предка
-
Понятия моно- поли- и парафилии - ключевые термины в таксономии филогенетике.
Монофилия (др. греч. μόνος — один и φυλή — семейный клан) — происхождение таксона от одного общего предка Парафилия- Парафилетическая группа включает ближайшего общего предка, но в отличие от монофилетической, не всех потомков Парафилетическую группу невозможно охарактеризовать уникальными cинапоморфиями. Все общие свойства, которые можно указать для её представителей относятся к симплезиоморфиям (унаследованы от более отдаленных предков, чем ближайший общий предок представителей группы) или гомоплазиям (возникли у разных представителей исследуемой группы независимо). Полифилия (др. греч. πολύς — многочисленный и φυλή — семейный клан) — происхождение таксона от разных предков
-
A: monophyletische Gruppe B: paraphyletische Gruppe C: polyphyletische Gruppe
A B C
-
Паралельная эволюция независимая эволюция одинаковых изменений при наличии общего предка Конвергентная эволюция независимая эволюция одинаковых изменений при наличии разных предков Повторная потеря Возврат к предковым признпкам Три возможных типа гомологии признаков (Гомоплазии - Homoplasy). (независимая эволюция одинаковых изменений)
-
Synapomorphy Homoplasy Apomorphy Plesiomorphy Autapomorphy Предковый статус – Розовый Продвиннутый статус- голубой
-
Кладограмма: Показывает путь происхождение от одного предка Филлограмма: Дает дополнительную информацию о присхождении: длина ветвей. Числа отражают количество еволюционных изменений на ветвях. Хронограмма Особый вид дерева, в рамках которого все еволюционные изменения пересчитаны (откалиброваны) на эволюционное время. Эволюционное время выражено либо в виде дивергенции последовательностей или непосредственно в годах. Кладограммы, Филлограммы и Ультрамерные дереья
-
Что отражают горизонтальные и вертикальные оси у различных типов деревьев? Только последовательность дивергенции Число эволюционных изменений на ветвях. Число эволюционных изменений на ветвях хорошо коррелирует с временем
-
Укорененные (rooted) и неукорененные (unrooted) деревья Укорененные деревья: показывают направление от предка к потомкам Неукорененные деревья: Мы не можем говорить о предках и потомках, а только о дивергенции
-
С B H O G Например: Для этого неукорененного дерева........
-
есть 7 отличающихся соответствующих укорененных деревьев!
-
Очень важно различать укорененные и неукорененные деревья Поскольку многие филогенетические методы реконструкции генерируютнеукорененные деревьяи не могут самостоятельно выявить различие между этимисемью укорененных деревьев. Un = (2n-5) (2n-7)......(etc) Количество возможных неукорененных деревьев Un для n сиквенсов Rn = (2n-3) (2n-5)......(etc) Количество возможных укорененных деревьевRn для n сиквенсов
-
Количество возможных деревьев возрастает в геометрической прогрессии при возрастании количества сиквенсов Количество Количество Количество Сиквенсов неукорененных укорененных деревьев деревьев 2 1 1 3 1 3 4 3 15 5 15 105 6 105 945 7 945 10395 8 10395 135135 9 135135 2027025 10 2027025 344594425
Нет комментариев для данной презентации
Помогите другим пользователям — будьте первым, кто поделится своим мнением об этой презентации.