Содержание
-
Молекулярно-генетические методы диагностики
-
К молекулярно-генетическим методам диагностики относят амплификационные технологии, гибридизационный анализ нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК, методы ДНК-чипов оптические сенсоры.
-
Секвенирование (sequencing) – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК (сиквенс от англ. Sequence). Существует два основных метода секвенирования; метод Максама-Гилберта (основан на химическом расщеплении ДНК по одному основанию) и метод Сангера (дидезокси-метод). Самый распространенный на сегодняшний день способ секвенирования ДНК — «метод терминации цепи», или «дидезокси метод», разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером. Так был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сэнгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике
-
Особенность метода заключается в использовании химически модифицированных разновидностей четырех дезоксирибонуклеотидов, составляющих цепи ДНК- дидезоксинуклеотидов. Дидезоксинуклеотид лишен гидроксильных групп при атомах сахарного кольца не только в 2'-, но и в З'-положении, что делает его неспособным формировать фосфодизфирную связь со следующим нуклеотидом, что приводит к остановке синтеза ДНК. Такие дидезоксинуклеотиды получают путем синтеза. Каждая разновидность «помечена» флуоресцентной молекулой-маркером
-
Принцип метода терминации
Фрагменты ДНК, последовательность которых предстоит определить, многократно копируются (амплифицируются), затем нарезаются на короткие куски, которые затем служат матрицей для синтеза полностью комплементарных цепей ДНК. Далее проводят гибридизацию изучаемого фрагмента ДНК с праймером Праймер инициирует синтез ДНК в определённой точке цепи ДНК-матрицы, и с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная цепь. При этом видоизменённые разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи.
-
Этапы секвенирования
В четырех пробирках находятся: праймеры; набор из четырех дезоксинуклеотидов dATP, dCTP, dGTP и dTTP; по одному из четырех флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP); ДНК-полимераза и исследуемый образец ДНК 1 этап: гибридизация ДНК с праймером 2 этап: ферментативный синтез ДНК 3 этап: денатурация полученных продуктов (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер) 4 этап: электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов) 5 этап: анализ результатов
-
Во время синтеза ДНК включение дидезоксинуклеотида обрывает синтез, в результате получается смесь, содержащая полный набор ново-синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы. Например, в пробирке, где все последовательности заканчиваются на Т, получилась бы смесь: ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTTTA (образец)ATATGCAGAACAGACGATATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTTATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTTT Если идет синтез, и в первой позиции матрицы стоит А, то может встроиться обычный Т и синтез пойдет дальше, а может встроиться ddТTP и синтез дальше не пойдет. Произойдет обрыв цепи, а полученный синтезированный фрагмент займет при фракционировании определенную позицию согласно своему размеру. Следующий обрыв будет соответствовать второй букве секвенируемой нити, и также займет свою позицию согласно длине при фракционировании на электрофорезе и т.д. И так по каждому нуклеотиду. То есть, по размеру синтезированных фрагментов может быть определена локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК.
-
Процесс секвенирования по методу Сенгера может быть автоматизирован Если каждую из букв терминирующих синтез пометить в свой цвет, то все терминаторы можно объединить в одной пробирке и фракционировать продукты в одной дорожке. Обрыв синтеза в позиции данной буквы даст фрагмент со своим положением в геле после фракционирования. Каждое положение обрыва будет характеризоваться цветом той- буквы терминатора, на которой произошел обрыв. В ходе фракционирования терминированных фрагментов лазер будет фиксировать на детекторе последовательные пики - какая прошла полоса по счету, и какого она цвета. Далее эта последовательность пиков дешифруется в последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК.
-
Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные гелем. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. (Фрагменты ДНК — по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от «минуса» к «плюсу».) Процесс, называемый капиллярным электрофорезом, настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. По мере того как фрагмент появляется, он освещается лазером, что заставляет светиться меченый нуклеотид на его конце. Компьютер определяет разновидность этих нуклеотидов и регистрирует последовательность их появления, складывая «буквы» (нуклеотиды) в «текст» (последовательность ДНК).
-
ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЕ
Весь геном, все его молекулы ДНК, случайным образом фрагментируются на кусочки по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, к каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер», который позволяет отдельным цепям налипать на пластиковые бусинки. (Последовательность этого олигонуклеотида позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу.) При этом смесь разъединённых на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким образом, что каждая бусинка получает лишь по одной (!) индивидуальной цепи. .
-
Каждая бусинка оказывается заключённой в капельку, окруженную маслом и содержащую смесь для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая и проходит отдельно в каждой капельке эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР, эПЦР). Это приводит к «клональной амплификации» цепей ДНК, а говоря по-русски, к тому, что на поверхности бусинки удерживается уже не одна, а около 10 млн. копий («клонов») уникальной ДНК-матрицы. Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в ходе ПЦР) разделяются, и бусинки, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, помещаются в лунки «предметного стекла» — слайда особой конструкции. Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор», в котором и будет происходить реакция секвенирования
-
Схема пиросеквенирования. А — ДНК фрагментируется, к фрагментам пришиваются олигонуклеотиды-«адаптеры»; полученные двуцепочечные молекулы ДНК разделяются на две комплементарные цепи. Б — Одноцепочечные молекулы ДНК прикрепляются к бусинкам в условиях, стимулирующих попадание лишь одной молекулы на бусинку. Отдельные бусинки заключаются в капли реакционной смеси, окруженные маслом. Количество молекул на бусинке увеличивается в миллионы раз в результате эмульсионной полимеразной цепной реакции (эПЦР). В — Эмульсия разбивается, и цепи ДНК-фрагментов, образовавшиеся в результате эПЦР, разделяются. Бусинки, несущие на своей поверхности миллионы одноцепочечных копий первоначального фрагмента ДНК, помещаются в лунки оптико-волоконного слайда, по одной в каждую лунку.
-
Схема пиросеквенирования. Г — В каждую лунку добавляются бусинки поменьше, несущие на своей поверхности ферменты, необходимые для пиросеквенирования. Д — Микрофотография эмульсии, изображающая «пустые» капли и капли, содержащие бусинки с ДНК-матрицей. Толстая стрелка указывает на 100-мкм каплю, тонкая — на 28-мкм бусинку. Е — Микрофотография фрагмента оптико-волоконного слайда, полученная при помощи сканирующего электронного микроскопа. Видна плакировка оптических волокон и пустые лунки.
-
Каждый слайд несёт около 1,6 миллионов лунок, в каждую из которых попадает одна (!) бусинка с ДНК-матрицей. Слайд помещается в проточную камеру таким образом, что над отверстиями лунок создаётся канал высотой 300 мкм, по которому в лунки поступают необходимые реактивы. Помимо бусинок с ДНК-матрицей, в каждую лунку «насыпают» ещё бусинок помельче — каждая с «сидящими» на её поверхности (иммобилизованными) ферментами, необходимыми для пирофосфатного секвенирования. Нуклеотиды (одного вида за раз) и другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются последовательно в проточную камеру, куда помещается слайд. Каждый раз, когда определённый нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из лунок, в ней высвобождается молекула пирофосфата, которая, в свою очередь, является необходимым предшественником компонента другой ферментативной реакции.
-
Образовавшийся пирофосфат превращается в лунке в АТФ под действием ещё одного фермента — АТФ-сульфурилазы. И тогда в присутствие АТФ люцифераза светлячка Photinus pyralis окисляет люциферин до оксилюциферина, а эта реакция сопровождается хемилюминесценцией — по-простому, маленькой вспышкой света. Дно слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, подключённым к прибору с зарядовой связью (CCD-сенсор, charge coupled device). Это позволяет регистрировать излучаемые фотоны со дна каждой индивидуальной лунки, в которой произошло встраивание известного нуклеотида.
-
Прибор с зарядовой связью (CCD-сенсор) — предназначен для преобразования энергии электромагнитного излучения оптического диапазона в электрическую. Он обладает высокой чувствительностью, разрешающей способностью и быстродействием. Используется в качестве фотоприемника в видеокамерах, цифровых фотоаппаратах, сканерах и т. д. Конструктивно имеет матричное (многоплощадочное) исполнение, включающее от одной до нескольких линеек фоточувствительных микроповерхностей.
-
Вверху — так выглядит система для высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК — секвенатор Roche (454) Genome Sequencer FLX (2007). Изображение с сайта 454 Life Sciences. Внизу — схема секвенатора. Инструмент состоит из трех основных блоков: А — система микронасосов для подачи реактивов; Б — проточная камера, содержащая оптико-волоконный слайд с лунками-реакторами; В — оптико-волоконная система с CCD-сенсорами для регистрации сигналов. Прибор также включает в себя встроенный компьютер с необходимым программным обеспечением для управления всем процессом.
-
Пиросеквенатор "454 Life Sciences"
Прибор для секвенирования ДНК нового поколения может производить за сутки столько же данных, сколько несколько сотен сэнгеровских капиллярных секвенаторов, но управляется одним человеком
-
БИОЧИПЫ
Количество таких полинуклеотидных ячеек, а следовательно, и количество различных нуклеотидных последовательностей может превышать 1 млн на 1 см2 , их длина варьируется от 9-10 до 1000 нуклеотидов. Эти одноцепочечные фрагменты выступают в роли зондов, с которыми гибридизуются комплементарные им цепи ДНК из исследуемого образца, обычно меченные флуоресцентным красителем. Чем больше в образце молекул ДНК с определенной последовательностью, тем большее их количество свяжется с комплементарным зондом, и тем сильнее будет сигнал в точке микрочипа, куда был «посажен» соответствующий зонд ДНК-чип представляет собой пластину площадью около 1 см2 , на которой в строго определенном порядке размещены ячейки, каждая из которых содержит одноцепочечные полинуклеотиды одной определенной последовательности оснований.
-
Существуют два основных направления создания ДНК-чипов. Исторически первыми были методы размещения на чипах предварительно химически синтезированных олигонуклеотидов или полученных с помощью ПЦР одно-цепочечных фрагментов ДНК. Эти методы просты в использовании, необходимое оборудование доступно и относительно дешево. Самым главным преимуществом является высокая гибкость этих методов, позволяющая создать чип с любыми требующимися последовательностями
-
Другим более перспективным направлением является применение разработанных для нужд микроэлектроники литографических технологий с использованием ультрафиолетового излучения. Такая технология позволяет синтезировать олигонуклеотиды непосредственно на поверхности чипа. Последним достижением в данной области стала разработка в 1999 году технологии позволяющей обойтись без литографических масок. Это делает синтез чипов с плотностью олигонуклеотидов любой заданной последовательности превышающей 1 000 000 на 1 см2 доступным любой лаборатории.
-
Главной отличительной чертой этой технологии является возможность одновременного анализа огромного количества различных ДНК-последовательностей. Появилась ранее недоступная возможность изучать геном как целое. Это новое направление получило название "геномика". Применение ДНК-чипов позволяет количественно определить уровень экспрессии всех генов любого генома. Особенно важным является установление функциональной роли генов - функциональная геномика. Установление функций генов позволяет разработать методы этиологической диагностики патологических состояний, например злокачественного роста и способы управления функцией генов, которые ответственны за их развитие, в том числе и с помощью такого наиболее перспективного метода как генная терапия.
-
-
-
-
Fig. 1. Schematic illustration of the microfluidic biochips with on-chip molecularly imprinted biosensors for anesthetic sensing and the working principle: (a) the whole microfluidic system, (b) the microfluidic biochip, and (c) the working principle of molecular imprinting.
Нет комментариев для данной презентации
Помогите другим пользователям — будьте первым, кто поделится своим мнением об этой презентации.