Презентация на тему "МодификацииПЦР"

Содержание

• 
  Слайд 1

  МодификацииПЦР

  Выполнила: студентка 6 курса МБФ (3 группа) Рубилкина В. С.

• 
  Слайд 2
  

  ПЦР — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Виды: 1. ПЦР в реальном времени; 2. ПЦР с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР); 3. Метод NASBA; 4. Гнездовая ПЦР; 5. Инвертированная ПЦР и др;

• 
  Слайд 3

  ПЦР в реальном времени

  ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. Real-time PCR, qPCR) — лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК.

• 
  Слайд 4
  

  Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце.

• 
  Слайд 5
  

  Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода: 1) флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК; 2) модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

• 
  Слайд 6
  

  Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани

• 
  Слайд 7

  ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

  представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК). Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции в комплементарную ДНК (cDNA) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР.

• 
  Слайд 8
  

  Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу: 1. Реакция первой цепочки: Комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C. 2. Реакция второй цепочки: После того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР. После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.[

• 
  Слайд 9
  

  ОТ-ПЦР обычно используется при изучении вируса иммунодефицита человека, так как ВИЧ является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина. Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов.

• 
  Слайд 10

  Метод NASBA

  Метод NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplificaition)- транскрипционный метод амплификации. Методика основана на выделении РНК микроорганизма из исследуемого материала, в отличие от традиционной ПЦР. На сегодняшний день является наиболее современным методом диагностики и контроля лечения ряда инфекций передаваемых половым путем (ИППП).

• 
  Слайд 11
  

  преимущества метода NASBA: - высокая чувствительность - высокая специфичность - возможность раннего контроля проводимого лечения - диагностика скрытых, хронических и персистирующих форм заболеваний, выявление возбудителя во время инкубационного периода - обследование половых партнеров на носительство ИППП - подтверждение результатов других лабораторных методов: бактериальный посев, микроскопия, ИФА (иммуноферментный анализ), метод ПЦР и др.

• 
  Слайд 12
  

  Недостатки: метод NASBA определяет живые микроорганизмы, в том числе и их некультивируемые формы. В случае гибели микроорганизмов результат NASBA будет отрицательным даже при избытке ДНК погибших клеток.

• 
  Слайд 13

  Гнездовая ПЦР

  гнездовая ПЦР (nested polymerase chain reaction, nested PCR)- вариант полимеразной цепной реакции с использованием двух пар праймеров (внешних и внутренних), одна из которых способна амплифицировать внутренний участок ампликона, полученного после первого раунда амплификации с внешней парой праймеров.

• 
  Слайд 14
  

  Существует несколько вариантов применения Г.п.ц.р. в лабораторной диагностике. Напр., в одном из вариантов проводится амплификация (15—30 циклов) с внешней парой праймеров, при этом амплифицируется основной фрагмент ДНК. Далее часть содержимого переносится в новую пробирку, содержащую реакционную смесь, в состав которой входит пара праймеров, узнающая последовательности, лежащие внутри основного ампликона. Второй раунд амплификации (реамплификации) также составляет также 15-30 циклов.

• 
  Слайд 15
  

  В другом варианте температура отжига внутренней пары праймеров подбирается с таким расчетом, чтобы при проведении первого раунда амплификации они не участвовали в реакции. Обычно температура отжига праймеров в этом варианте подбирается на 10—15°С ниже, чем для внешней пары праймеров. программа амплификации в этом случае состоит из двух программных блоков. После проведения первого программного блока амплификации температура отжига праймеров для второго раунда задается на 10 градусов ниже, что обеспечивает эффективное участие внутренней пары праймеров во втором раунде амплификации. По сравнению со стандартной полимеразной цепной реакцией Г.п.ц.р. имеет более высокую чувствительность и специфичность.

• 
  Слайд 16

  Инвертированная ПЦР (Inverse PCR )

  используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

• 
  Слайд 17

  Асимметричная ПЦР (Asymmetric PCR)

  проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является англ. Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой (температурой плавления), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов.

• 
  Слайд 18

  Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR )

  С помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймергибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.

• 
  Слайд 19

  Виртуальная ПЦР

  математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной реакции, использующий данные о нуклеотидных последовательностях праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации фрагментов исследуемого генома, хромосомы, или любого другого участка ДНК. Этот инструмент используют для оптимизации подбора праймеров или ДНК-зондов к ДНК-мишени. Праймеры анализируются на наличие участков связывания и определяется степень их комплементарности к ДНК-мишени.

• 
  Слайд 20
  

  Некомплементарныеоснования в участке связывания праймера с ДНК-мишенью снижают стабильность праймера, так как снижают температуру плавления, а также некомплементарные основания в 3'-конце праймера ингибируют инициацию синтеза ДНК в ПЦР с помощью ДНК-полимеразы Taq, которая не обладает корректирующей 3',5'-экзонуклеазной активностью. Если же некомплементарные основания находятся только на 5'-конце праймера и праймер стабилен при конкретной температуре отжига, то в этом случае Taq-полимераза будет использовать данный праймер как затравку для начала синтеза ДНК, комплементарной ДНК-мишени.

• 
  Слайд 21
  

  Результат ПЦР insilico с помощью программы jPCR. Показаны места отжига праймеров и потенциальный ПЦР-продукт

• 
  Слайд 22

  Другие виды ПЦР

  Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) — ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифическогомежгенногоспейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположный этому методу является — уникальная ПЦР (англ. unique PCR), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей.

• 
  Слайд 23
  

  Вложенная ПЦР (NestedPCR) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеровамплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

• 
  Слайд 24
  

  ПЦР длинных фрагментов (Long-rangePCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (т.е. способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимераза берётся в 25—100 раз больше по отношению к Pfu-полимеразе.

• 
  Слайд 25
  

  ПЦР с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие антитела небольшими молекулами типа Affibody, то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.

• 
  Слайд 26
  

  RAPD (англ. RandomAmplificationofPolymorphic DNA), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

• 
  Слайд 27
  

  Метод ПЦР с детекцией по "конечной точке" (FLASH - FluorescentAmplification-basedSpecificHybridization) позволяет учитывать результаты ПЦР не открывая пробирки, непосредственно после проведения ПЦР, что исключает возможность загрязнения ПЦР-лаборатории ампликонами. ПЦР в модификации FLASH исключает стадии анализа продуктов ПЦР методом электрофореза и гель-документации результатов электрофореза, что позволяет сократить время полного ПЦР-анализа до 2-3 часов и снизить стоимость комплекта оборудования для ПЦР-лаборатории. Регистрация флуоресценции при FLASH-детекции происходит по окончании реакции ПЦР (по "конечной точке" - "end-pointdetection") на детекторе флуоресценции, который регистрирует флуоресцентное свечение реакционной смеси в пробирках непосредственно после проведения ПЦР.