Презентация на тему "Основы генной инженерии и биотехнологии"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Основы генной инженерии и биотехнологии

  Лекция 1 Вводная

• 
  Слайд 2

  Патрушев Лев Ивановичд.б.н., в.н.с., профессор

  Экспериментальные и теоретические исследования, проводимые в нашей Группе анализа и коррекции генома лаборатории биотехнологии ИБХ РАН: Проблемы мутагенеза ДНК-диагностика на основе ПЦР

• 
  Слайд 3

  Курс лекций по основам генной инженерии и биотехнологии

  Введение в молекулярную биологию и генетику Классическая генная инженерия Полимеразная цепная реакция Исследования геномаи транскрипции генов Антисмысловые технологии, аптамеры, рибозимы Генная инженерия в конструировании белков Трансгенные животные Трансгенные растения Рекомбинантные флуоресцирующие белки Рекомбинантные антитела

• 
  Слайд 4
  

  «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов, а не новых концепций. Новые концепции объясняют известные явления по-новому. Новые методы открывают новые явления, которые необходимо объяснить.»Freeman J. Dyson

• 
  Слайд 5

  Генетика – наука о наследственности

  Грегор Мендель (1822-1884) Австрийский священник и ботаник Природа с красоты своей Покровов снять не позволяет, И ты машинами не вынудишь у ней, Чего твой Дух не угадает… Владимир Соловьев

• 
  Слайд 6

  Три основных направления генетических исследований

  Классическая генетика Менделевские принципы наследования, митоз и мейоз, картирование хромосом, механизмы определения пола, цитогенетика Молекулярная генетика Структура и химия нуклеиновых кислот, клонирование ДНК и геномика, молекулярные механизмы хранения, реализации и воспроизведения генетической информации, мутагенез и репарация ДНК, рекомбинация Эволюционная генетика Генетика количественных признаков, распределение генов в популяциях, механизмы видообразования

• 
  Слайд 7

  Что такое «генная инженерия»?

  Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем с использованием манипуляций генами на молекулярном уровнепутем конструирования рекомбинантных ДНК или РНК Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма de novoпо чертежам, разработанным в лаборатории - «синтетическая биология»

• 
  Слайд 8
  

  В классической генетике и селекции – отбор среди потомства по определенным признакам ограничен репродуктивной изоляцией В генной инженерии при получении трансгенных организмов такие ограничения действуют слабее Генная инженерия облегчает обмен генами между природными генетическими системами

• 
  Слайд 9
  

  Клонированная самка муфлона, родившаяся у овцы, использованной в качестве приемной матери

  Перенос ядра соматической клетки погибшего муфлона в энуклеированную яйцеклетку овцы Нормальные роды после 155 дней беременности Самец муфлона

• 
  Слайд 10

  Влияние генной инженерии на современную биологию

  Исследование структуры геномов и индивидуальных генов, выяснение их функций (функциональная геномика) Получение экспрессии рекомбинантных генов в новом генетическом окружении - трансгенез Белковая инженерия Появление технологий, основанных на антисмысловых последовательностях Создание аптамеров, рибозимов и дезоксирибозимов Синтетическая биология

• 
  Слайд 11

  Биотехнология

  Область прикладной биологии, занимающаяся использованием живых организмов и биопроцессов для получения необходимой продукции 1980 – Верховный суд США подтвердил патентоспособность микроорганизмов, изготовленных человеком Клетки E.coli под сканирующим электронным микроскопом

• 
  Слайд 12

  Промышленная (белая) биотехнология

  Производство продуктов питания, микроорганизмов, белков и ферментов, ферментативный синтез низкомолекулярных соединений, животные- и растения-биореакторы, добыча редких химических элементов, сохранение окружающей среды, биотопливо

• 
  Слайд 13
  

  Сельскохозяйственная (зеленая) биотехнологияGreen gene technology (GGT)

  Улучшение потребительских свойств растений Устойчивость к патогенам, гербицидам и пестицидам Одновременное созревание плодов Повышение их стабильности 100 млн. га засеяно генетически модифицированными (GM) растениями Теосинте (Euchlaenamexicana) и початок GM-кукурузы

• 
  Слайд 14
  

  Мочить генных инженеров!

• 
  Слайд 15

  Фармацевтическая (красная) биотехнология – Red Biotech

  Биотехнологическое производство препаратов медицинского назначения (витамины, белки и пептиды, ДНК-вакцины и т.п.) Водная (голубая) биотехнология – Blue Biotech Биотехнологическое производство веществ и пищевых продуктов из морских и пресноводных организмов, контроль их размножения

• 
  Слайд 16

  Влияние генной инженерии на современную медицину

  Терапевтические нуклеиновые кислоты: Генотерапия Репарация генов Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды Олигонуклеотидные аптамеры ДНК-вакцины Терапевтические белки (биофарминг): Инсулин, гормон роста человека, факторы свертывания крови Терапевтические небольшие молекулы Антибиотики, хиральные метаболиты, витамины, аминокислоты (метаболическая инженерия) Фармакогеномика Предсказание побочного действия лекарств (цитохром P450) и исследование механизма их действия на экспрессию генов

• 
  Слайд 17
  

  ДНК-диагностика: Наследственные заболевания, Инфекционные заболевания, Приобретенные заболевания (в том числе рак), Диагностические белки: Маркеры заболеваний человека и животных Животные, моделирующие заболевания человека Рак, атеросклероз, ожирение, аутоиммунные заболевания и т.п. Рекомбинантные вакцины, ДНК-вакцины Гепатит B – экспрессия антигена на поверхности клеток дрожжей Антирабические вакцины (бешенство у животных)

• 
  Слайд 18

  Центральная догма молекулярной биологии

  В живом организме генетическая информация передается от ДНК через РНК к белку В специальных случаях (обратной транскрипции) имеет место передача информации от РНК к ДНК Одноцепочечную ДНК можно транслировать рибосомами invitro в присутствии аминогликозидных антибиотиков Три способа передачи генетической информации в живых организмах, предполагаемых ЦДМБ

• 
  Слайд 19

  ДНК и РНК

  Рибоза Дезоксирибоза Сахаро-фосфатный остов ДНК (5-метилурацил)

• 
  Слайд 20

  Пуриновые и пиримидиновые основания ДНК

  Азотистые основания Гетероциклические ароматические химические соединения У пуринов молекула пиримидина объединена с кольцом имидазола

• 
  Слайд 21

  Комплементарные взаимодействия

  Erwin Chargaff Азотистые основания, соединяясь ковалентной связью с 1‘-атомом рибозы или дезоксирибозы, образуют N-гликозиды, которые называют нуклеозидами

• 
  Слайд 22

  Водородные связи между молекулами воды

  Слабое электростатическое взаимодействие между положительно заряженными атомами водорода и отрицательно заряженными электроотрицательными атомами

• 
  Слайд 23

  Три модели молекулы ДНК

  Цепи ДНК антипараллельны, 3’- и 5’-концы молекулы ДНК, правозакрученная спираль

• 
  Слайд 24

  Компьютерные модели A-, B- и Z-форм ДНК

  A B Z A-форма:ДНК-РНК- гибриды, 11 пар нуклео- тидов/виток спирали B-форма: обычная конформация ДНК в клетке Z-форма: Левозакрученная спираль poly[dG-dC] ⋅ poly[dG-dC] Отрезки ДНК одинаковой длины

• 
  Слайд 25

  Плавление (денатурация) ДНК Streptococcus pneumoniae

  Факторы, влияющие на Tm: pH Ионная сила Органические растворители

• 
  Слайд 26

  Плавление (денатурация) ДНК

• 
  Слайд 27
  

  Температура плавления ДНК (Tm) – это температура, при которой цепи ДНК диссоциированы наполовину

• 
  Слайд 28

  Зависимость температуры плавления геномной ДНК от ее GC-состава

  В AT-ДНК содержание GC = 0 В природных ДНК содержание GC в пределах 22%-73%

• 
  Слайд 29

  Ренатурация (гибридизация, отжиг) ДНК и РНК

  Гибридизация – ренатурация различных цепей ДНК (ДНК-ДНК-гибриды) или ДНК и РНК (ДНК-РНК-гибриды) Температура гибридизации ниже температуры плавления ДНК

• 
  Слайд 30

  Кинетика ренатурации разных ДНК

  Сложность ДНК C0 - начальнаяконцентрация ДНК (нуклеотиды моль/л), t – времяренатурации (сек)

• 
  Слайд 31

  C0t-кривая для ДНК тимуса теленка

  Умеренно повторяющиеся НП (30%) C0t 1/2=0.04 Уникальные НП (60%) C0t 1/2=4000 Высоко повторяющиеся НП (10%) ренатурируют до начала эксперимента

• 
  Слайд 32

  Комплементарные последовательности

  Последовательности ДНК представляют в виде одной цепи, в которой 5’-конец слева, а 3’-конец справа Комплементарная инвертированная последовательность

• 
  Слайд 33

  Определение терминов: «Геном»

  Геном – совокупность всей ДНК гаплоидного набора хромосом, внехромосомных генетических элементов и органелл клетки зародышевой линии биологического вида Введен Г. Винклером в 1922 г. В отличие от термина «генотип» является биологической характеристикой вида в целом, а не отдельной особи Из-за большого числа аллельных вариантов генов и некодирующих последовательностей можно говорить лишь об усредненном геноме биологического вида (у человека обнаружено >50, 000,000 SNP) Геном митохондрий и хлоропластов

• 
  Слайд 34

  Концепция бактериального пангенома (pan-genome)

  Открытый пангеном Закрытый пангеном Несущественные гены Основные гены Метагеном– совокупность генов, циркулирующих в биосфере Метагеномика

• 
  Слайд 35

  Парадокс C (C-value paradox)

  Размер генома не коррелирует с биологической сложностью видов(их положением в эволюционной иерархии) C.A. Thomas, 1971 г. Размеры генома: Кузнечик – 17 pg Лошадь – 3,2 pg 1 pg ДНК = 1000 млн.п.н.

• 
  Слайд 36

  Растения с экстремальными размерами генома

  ЗемляникаFragariaviridis– 0,11 pg Рябчик Fritillariaassyriaca – 127,4 pg

• 
  Слайд 37

  Южноамериканская двоякодышащая рыба Lepidosirenparadoxa

  Размер генома – 120 pg, число хромосом (2n) – 38 1 pg ДНК = 1000 млн.п.н.

• 
  Слайд 38

  Животные–лидеры по размерам генома

  Двоякодышащие рыбы Хвостатые амфибии Саламандры (Американский протей) Ракообразные (Атлантическая глубоководная креветка) Плоские черви (Otomesostomaauditivum) Насекомые Кузнечики (Podismapedestris) Млекопитающие Летучая мышь Человек Красная крыса (Tympanoctomysbarrerae) 133 pg 121 pg 38 pg 20 pg 17 pg 1,7 pg 3,5 pg 8,4 pg 1 pg ДНК = 1000 млн.п.н.

• 
  Слайд 39

  Парадокс исчезает, загадка остается

  Большие различия в размерах геномов определяются последовательностями, не кодирующими белки и нуклеиновые кислоты Кодирующие последовательности (1) ~ 2% от всего генома

• 
  Слайд 40

  Последовательности нуклеотидов генома человека

• 
  Слайд 41

  Количество генов у организмов разных таксономических групп

  25 25

• 
  Слайд 42
  

  Сложность фенома быстро возрастает при небольшом увеличении количества генов

  Число генов, кодирующих белки: Человек, мышь –~28 000 Дрозофила – ~14 000 Число потенциальныхбиохимическихпризнаков, определяемых комбинаторным взаимодействием белков 10 разных генов: Человек, мышь – 8,15 × 1037 Дрозофила – 7,95 × 1034 Показано число сочетаний по 10 из 28000 или 14000

• 
  Слайд 43

  Резюме по геному

  Генно-инженерная работа с генами высших эукариот – их выделение и изучение функций – сильно затруднена из-за большой структурной сложности геномов (и самих генов) Секвенирование целых геномов облегчает эту задачу. Методы секвенирования ДНК нового поколения (NGS) Наступление «постгеномной эры».

• 
  Слайд 44
  

  Универсальный цикл транскрипциии последующая экспрессия синтезированной мРНК

• 
  Слайд 45

  Структура бактериального гена и его некоторых сильных промоторов

  terminator Регуляторная часть гена Структурная часть гена

• 
  Слайд 46
  

  Модули, контролирующие транскрипцию, в эукариотических генах, кодирующих белки

  TF - transcription factor – фактор транскрипции

• 
  Слайд 47
  

  Коровый промотор: минимальная последовательность нуклеотидов, обеспечивающая правильную инициацию транскрипции в отсутствие других цис-действующих элементовЭнхансеры и сайленсеры обеспечивают (ткане)специфическую транскрипцию конкретных генов, стимулируя или подавляя их экспрессию, соответственноИнсуляторыограничивают действие энхансеров и сайленсеров на соседние геныПроксимальная промоторная область включает коровый промотор и сайты связывания факторов транскрипции, влияющих на его активность

• 
  Слайд 48
  

  Элементы корового (базового) промотора эукариотической РНК-полимеразы II

  INR– инициатор, TATA– TATA-бокс, DPE- downstream promoter element (нижний промоторный элемент), MTE - motif ten element – все являются сайтами связывания субъединиц TFIID BRE– сайт TFIIB

• 
  Слайд 49

  Межмолекулярные взаимодействия на промоторе РНК-полимеразы II

  ФТ– факторы транскрипции; ОФТ– основные факторы транскрипции; РЭ– регуляторные элементы (последовательности) ДНК, КТ – коактиваторы транскрипции

• 
  Слайд 50

  Обобщенная структура эукариотического гена

• 
  Слайд 51

  Ген дистрофина человека и продукты его транскрипции

  Каждая молекула РНК-полимеразы II транскрибирует ген в течение нескольких дней

• 
  Слайд 52

  33 продукта альтернативного сплайсинга транскрипта одного гена

• 
  Слайд 53

  Редактирование мРНКпутем дезаминирования цитозина

• 
  Слайд 54

  Разнообразие механизмов редактирования мРНК (RNA editing)

  Изменение кодирующего потенциала мРНК путем: Вставок/делеций нуклеотидов U (реже С, A, G) митохондриальная мРНК простейших, (слизневиков) (нуклеазы, РНК- лигазы, gRNA) Дезаминирования азотистых оснований С -> U (мРНК аполипопротеина B), A -> I (вирусные, клеточные мРНК) Замены оснований в мРНК U -> С (реже U ->A или G, С ->A или A->G) (митохондрии растений, миксомицеты, одноклеточные простейшие) (делеции + вставки, трансгликозилирование)

• 
  Слайд 55

  Один ген – один фермент

  George Beadle E.L. Tatum Работы с мутантами Neurosporacrassa – добавление недостающих метаболитов

• 
  Слайд 56

  Концепция гена 1960-х годов

  Ген – последовательность ДНК или РНК, которая Непрерывна Интроны Однапоследовательность кодирует один белок (РНК) Могут использоваться все три ОРС, альтернативный сплайсинг Колинеарна кодируемому белку Сплайсинг белков, редактирование РНК Регуляторная часть предшествует структурной Энхансеры перед, внутри и за геном Имеет четкие границы Альтернативные сайты инициации и терминации транскрипции и трансляции Постоянную локализацию на хромосоме Мобильные генетические элементы Перемещения и изменения происходят только вследствие случайных мутаций Запрограммированные перестройки генов Ig, соматический мутагенез, адаптивные мутации

• 
  Слайд 57

  Основные свойства гена остались незыблемыми

  Ген – фрагмент нуклеиновой кислоты, в последовательности которой закодирована информация о последовательностях других НК или белков Изменения фенотипа организма однозначно (?) связаны с мутационными изменениями его генотипа (т.е. изменениями последовательностей генов Генотипические изменения являются наследуемыми

• 
  Слайд 58

  Хорошо забытое старое

  Ген – это часть генома, оказывающая влияние на какой-либо фенотипический признак организма Один ген – один признак

• 
  Слайд 59

  Центральная догма молекулярной биологии

  Формирование фенотипа под действием генотипа в соответствии с центральной догмой

• 
  Слайд 60

  Системные подходы в молекулярной биологии и генетике

• 
  Слайд 61
  

  Иммунопреципитация хроматина: исследование на биочипах (ChIP-chip) и секвенированием ДНК (ChIP-seq)

  Обратимое связывание белков с ДНК формальдегидом Обогащение фрагментов ДНК с помощью специфических антител Определение профилей ДНК с помощью биочипов (слева) или секвенированием (справа)

• 
  Слайд 62

  Хромосомные территории в интерфазном ядре фибробластов человека

  Многоцветная FISH (