Содержание
-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ С ОСНОВАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ К.б.н., доцент Гаврюшина Елена Сергеевна
-
Учебники
М.СИНГЕР, П.БЕРГ – ГЕНЫ и ГЕНОМЫ Б.ГЛИК и Д.ПАСТЕРНАК – МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ КАФЕДРЫ БИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ И ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
-
СВОЙСТВА ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ В ОСНОВНОМ ОПРЕДЕЛЯЮТСЯ ИХ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМОЙ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА – МОЛЕКУЛЯРНАЯ СИСТЕМА, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ САМОВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ, СВОЙСТВА, НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ, ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ЭВОЛЮЦИЮ ОРГАНИЗМОВ
-
СХЕМА РАБОТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
ДНК РНК БЕЛОК ГЕНОМ ПЕРЕДАЧА ИНФОРМАЦИИ ПОРЯДОК АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКЕ
-
ГЕНОМ – СОВОКУПНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА (ДНК) КЛЕТКИ (ОРГАНИЗМА) ДНК –ЭТО БИОПОЛИМЕР, ПОСТРОЕННЫЙ ИЗ 4 ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ (А,Т,Г,Ц)
-
ГЕН, ГЕНОТИП, ФЕНОТИП
ГЕН – единица наследственности, участок ДНК, кодирующий определенную РНК (и белок) ГЕНОТИП –совокупность генов организма ФЕНОТИП – совокупность свойств организма в условиях внешней среды
-
ОТКРЫТИЕ ГЕНОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Г. МЕНДЕЛЬ – ОТКРЫТИЕ ГЕНОВ И ВОЗНИКНОВЕНИЕ ГЕНЕТИКИ (1865) Ф.МИШЕР – ОТКРЫТИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ («НУКЛЕИНА») (1869)
-
ЧАРГАФФ (1951) – В ДНК А=Т, Г=Ц ФРАНКЛИН и УИЛКИНС – ДНК - СПИРАЛЬ УОТСОН И КРИК (1953) – ДНК – ДВОЙНАЯ СПИРАЛЬ; А-Т, Г-Ц
-
Роль РНК в биосинтезе белка (1950-е-1960-е г.г.)
Информационная РНК Рибосомальная РНК Транспортная РНК Малые РНК
-
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
НИРЕНБЕРГ, ХОРАНА И ДР. (1961-1966)- РАСШИФРОВКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА Три нуклеотида одна аминокислота Получена таблица генетического кода
-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ ФУНКЦИЙ МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ В КЛЕТКЕ И ОРГАНИЗМЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
-
РЕСТРИКТАЗЫ
НАТАНС, АРБЕР, СМИТ – ОТКРЫТИЕ РЕСТРИКТАЗ (1970) РЕСТРИКТАЗЫ – БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ, РАЗРЕЗАЮЩИЕ МОЛЕКУЛУ ДНК В ОПРЕДЕЛЕННЫХ ТОЧКАХ
-
ЛИГАЗЫ
ФЕРМЕНТЫ, СОЕДИНЯЮЩИЕ КОНЦЫ ДНК
-
ВОЗНИКНОВЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙИНЖЕНЕРИИ
П. БЕРГ (1972) СОЕДИНИЛ ГЕНОМЫ ДВУХ ВИРУСОВ (БАКТЕРИОФАГАλ И ВИРУСА SV40) И ПОКАЗАЛ РАЗМНОЖЕНИЕ ЭТОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ МОЛЕКУЛЫ В БАКТЕРИЯХ
-
КОЕН И БОЙЕР (1973) – ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЛАЗМИД ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК; РАЗРАБОТКА УДОБНЫХ ПРИЕМОВ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКИХ МОЛЕКУЛ
-
РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК
ОБЪЕДИНЕНИЕ (РЕКОМБИНАЦИЯ) ДВУХ МОЛЕКУЛ ДНК – ВЕКТОРА И ВСТАВКИ
-
ВЕКТОР
ЭТО МОЛЕКУЛА ДНК, СПОСОБНАЯ РАЗМНОЖАТЬСЯ В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ (ПЛАЗМИДЫ, ВИРУСНЫЕ ДНК)
-
ВСТАВКА
ЭТО ЛЮБОЙ ФРАГМЕНТ ДНК (НАПРИМЕР, ОПРЕДЕЛЕННЫЙ ГЕН), КОТОРЫЙ НУЖНО ВСТАВИТЬ В ВЕКТОР ДЛЯ ОЧИСТКИ И НАКОПЛЕНИЯ
-
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
- ЭТО КОМПЛЕКС ПРИЕМОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЕННО ИЗМЕНЕННЫХ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК
-
ВАЖНЕЙШИЕ МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ И АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
-
ВОЗМОЖНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
ВЫДЕЛЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ГЕНОВ ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЗМАХ СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ С ПРИНЦИПИАЛЬНО НОВЫМИ СВОЙСТВАМИ
-
ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ И КЛЕТКИ
ВИРУСЫ, БАКТЕРИИ, ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ, ЖИВОТНЫЕ, РАСТЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ В СВОЕМ ГЕНОМЕ ЧУЖЕРОДНЫЙ ГЕН(Ы), ВВЕДЕННЫЙ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
-
ВОЗНИКНОВЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ
В 1960-е г. БЫЛА СОЗДАНА ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ОБЪЕДИНЯЮЩИХ ГЕНОМЫ ДВУХ ТИПОВ КЛЕТОК ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕСАДКИ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА
-
КЕЛЕР И МИЛЬШТЕЙН (1975) ПОЛУЧИЛИ ГИБРИДЫ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ЛИМФОЦИТОВ (ГИБРИДОМЫ), ПРОДУЦИРУЮЩИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА
-
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
- СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ КЛЕТОК НА ОСНОВЕ ИХ СЛИЯНИЯ ИЛИ ПЕРЕСАДКИ ЯДЕР
-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
- НАУКА О СОЗДАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ОРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ И В НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ОСНОВАНА НА:
ГЕНЕТИКЕ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКЕ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ БИОХИМИИ КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ФИЗИОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ
-
ВОЗМОЖНОСТИМОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
ПРОДУКЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ СОЗДАНИЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВ СОЗДАНИЕ ВАКЦИН И ДИАГНОСТИКУМОВ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ГЕНОМНАЯ ДАКТИЛОСКОПИЯ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА ПИЩИ, УЛУЧШЕНИЕ ЕЕ КАЧЕСТВА (СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ) БОРЬБА С ЗАГРЯЗНЕНИЕМ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МОЩНЫЙ ИНСТРУМЕНТ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
-
ОПАСНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ (ПРОБЛЕМА БИОБЕЗОПАСНОСТИ)
ВОЗМОЖНОЕ НЕГАТИВНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ТРАНСГЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ПРОДУКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ С ИХ ПОМОЩЬЮ, НА ПРИРОДУ И ЧЕЛОВЕКА
-
БИОПОЛИМЕРЫ КЛЕТКИ
БЕЛКИ (ПОСТРОЕНЫ ИЗ АМИНОКИСЛОТ) НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ - ДНК и РНК (ИЗ НУКЛЕОТИДОВ). Цепь соединенных между собой нуклеотидов называется олиго- или полинуклеотидом. ПОЛИСАХАРИДЫ (ИЗ МОНОСАХАРОВ)
-
Фридрих Мишер открыл НК (1869)
-
Фебиус Ливин выявил химическую структуру нуклеотидов и полинуклеотидов
-
НУКЛЕОТИДЫ
АЗОТИСТОЕ ОСНОВАНИЕ САХАР (ДЕЗОКСИРИБОЗА В ДНК, РИБОЗА В РНК) ФОСФАТ
-
-
Азотистые основания
Азотистые основания (АО)– это гетероциклические структуры, содержащие углерод (С) и азот (N). Пиримидиновые (Py) и пуриновые (Pu) АО
-
АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ
ДНК СОДЕРЖИТ 4 АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИЯ (T, C, A, G): ДВА ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЯ (ТИМИН-Т И ЦИТОЗИН-C) И ДВА ПУРИНОВЫХ ОСНОВАНИЯ (АДЕНИН- A И ГУАНИН-G) РНК ТАКЖЕ СОДЕРЖИТ 4 АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИЯ (U, C, A, G): ДВА ПИРИМИДИНА – УРАЦИЛ – U (ВМЕСТО ТИМИНА) И ЦИТОЗИН-С, ДВА ПУРИНА – АДЕНИН-А И ГУАНИН –G)
-
Тимин (в ДНК)
1 2 3 4 5 6
-
-
Цитозин
-
Аденин
1 3 2 4 5 6 7 8 9
-
Гуанин
-
Сахара нуклеиновых кислот
В состав нуклеотидов входят правовращающие (D) пятичленные сахара (пентозы), находящиеся в циклической форме: D-дезоксирибоза (в ДНК) D-рибоза (в РНК)
-
Дезоксирибоза
он О н HО 1’ 2’ 3’ 4’ 5’
-
Рибоза
он О он 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ HO
-
ФОСФАТ И ДИФОСФАТ (ПИРОФОСФАТ)
O Фосфат O P O(PO4) O O O Дифосфат O P O P O (P2O7) O O (пирофосфат)
-
ТРИФОСФАТ
O O O װװװ O ─ P ─ O ─ P ─ O ─ P ─ O ׀׀׀ O O O
-
Нуклеозиды
Нуклеозид – азотистое основание + сахар Рибонуклеозиды содержат рибозу Дезоксирибонуклеозиды содержат дезоксирибозу
-
Рибонуклеозиды Дезоксирибонуклеозиды Уридин (d)Тимидин Цитидин dЦитидин Аденозин dАденозин Гуанозин dГуанозин
-
Нуклеотиды
Нуклеотид – АО + сахар + фосфат Другое название - нуклеозидмонофосфат Название нуклеотида зависит от природы основания, сахара(рибо-или дезокси- рибонуклеотиды) и от числа фосфатных групп (нуклеозидмоно-, ди- и трифосфаты)
-
Рибонуклеотиды
Уридиловый (или уридинмоно-, ди-, трифосфат) - UMP, UDP, UTP Цитидиловый (или цитидинмоно-, ди-, трифосфат) – CMP, CDP, CTP Адениловый (или аденозинмоно-, ди-, трифосфат) - AMP, ADP, ATP Гуаниловый (или гуанозинмоно-, ди-, трифосфат)
-
Дезоксирибонуклеотиды
Дезокситимидиловый - dTMP, dTDP, dTTP Дезоксицитидиловый - dCMP, dCDP, dCTP Дезоксигуаниловый - dGMP, dGDP, dGTP Дезоксиадениловый - dAMP, dADP, dATP
-
Структура нуклеозидтрифосфата
-
Фосфодиэфирная связь
Соседние нуклеотиды в полинуклеотиде связаны фосфодиэфирной связьюмежду 3’-гидроксилом предыдущего и 5’-гидроксилом последующего нуклеотида O װ 3’C – O – P – O – C5’ ׀ O-
-
-
Полярность полинуклеотида
Полинуклеотиды имеют полярность – 5’- и 3’-концы
-
СТРУКТУРА ДНК
ЧАРГАФФ (1951) – В ДНК А=Т, Г=Ц ФРАНКЛИН и УИЛКИНС (1953) – ДНК – СПИРАЛЬ (РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ) УОТСОН И КРИК (1953) – ДНК – ДВОЙНАЯ СПИРАЛЬ; А-Т, Г-Ц(СТЕРЕОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ)
-
Френсис Крик и Джеймс Уотсон(1953)
-
-
ДНК – двойная спираль
Молекула ДНК состоит из двух антипараллельно направленных нитей, спаренных по принципу комплементарности азотистых оснований: А-Т, G-C 5’_______________________3’ 3’_______________________5’
-
Комплементарностьнуклеотидов в ДНК
-
Спиральная структура ДНК и РНК
-
Механизм спаривания нуклеотидов в комплементарных цепях
Спаривание осуществляется за счет образования водородных связей между донором (NH) и акцепторaми (N Ξ, O =) водорода.
-
Спаривание нуклеотидов в комплементарных цепях ДНК
-
Спирализация полинуклеотида
Спирализация происходит за счет межплоскостных взаимодействий между нуклеотидами в водной среде
-
Свойства двойной спирали ДНК
Антипараллельность цепей Комплементарное взаимодействие между нуклеотидами А-Т, G-C B-форма ДНК, расстояние между нуклеотидами 3.4 А (0.34 нм), на виток спирали – 10 нуклеотидов Существуют другие формы двойной спирали (А-форма, Z-форма), биологическая роль неизвестна
-
Варианты ДНК
Линейная двунитевая ДНК (эукариоты, вирусы) Кольцевая двунитевая ДНК (бактерии, вирусы, плазмиды) Кольцевая однонитевая ДНК (вирусы) Линейная однонитевая ДНК (вирусы)
-
Денатурация ДНК
Денатурация (плавление) двунитевой структуры происходит при 900-1000 С ________________________________ ________________________________ 1000 Плавление _________________________________ _________________________________
-
Ренатурация (отжиг) ДНК
Ренатурация (отжиг) комплементарных нитей ДНК происходит постепенно при t= 30-700 ____________________________________________________ ____________________________________________________ ____________________________________________________ ____________________________________________________
-
РНКу прокариот
Транспортная РНК (тРНК) – 75-80 н. (десятки видов) Рибосомальная РНК(рРНК) 5 S - 120н. (1-2 вида) 16 S - 1600н. (1 вид) 23 S - 3200 н. (1 вид) Матричная (информационная) РНК -гетерогенна (тысячи видов) Малая цитоплазматическая РНК -90-330н.(десятки)
-
РНК у эукариот
Транспортная РНК (тРНК) – 75-90 н. (десятки видов) Рибосомальная РНК(рРНК) 5 S - 120н. (1-2 вида) 5.8S 155н. (1 вид) 18 S - 1900н. (1 вид) 28 S - 5000 н. (1 вид) Матричная (информационная) мРНК -гетерогенна (десятки тысяч) Малая цитоплазматич. мцРНК -90-330н.(сотни?) Малая ядерная мяРНК - 60-220н. (сотни?)
-
ДНК и РНК: сравнение
ДНК содержит дезоксирибозу, РНК- рибозу ДНК содержит тимин, РНК- урацил В воде ДНК стабильнее, чем РНК РНК разрушается щелочью и имеет бóльшую плотность, чем ДНК В клетках ДНК- двойная спираль, РНК однонитевая молекула (у вирусов возможны все варианты) В клетках ДНК – хранитель информации, РНК – переносчик информации и функциональная молекула (у вирусов может быть хранителем информации)
-
Некоторые методыработы снуклеиновыми кислотами (НК)
Выделение НК Определение концентрации НК Разделение фрагментов ДНК и молекул РНК электрофорезом Ультрацентрифугирование НК Молекулярная гибридизация НК Радиоактивная метка НК и авторадио-графия
-
Определение концентрации нуклеиновых кислот
Спектрофотометрическое определение концентрации НК при λ=260 нм 1 ОЕ – 50 мкг/мл ДНК или 40 мкг/мл РНК
-
Электрофорез нуклеиновых кислот
Электрофорез в агарозном геле (длинные молекулы НК) Электрофорез в полиакриламидном геле (олигонуклеотиды)
-
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот
Объединение (отжиг) двух комплементарных последовательностей из разных молекул полинуклеотидов ДНК-ДНК гибридизация ДНК-РНК гибридизация РНК-РНК гибридизация
-
Молекулярная блот- гибридизация по Саузерну
Электрофорез препаратов ДНК в агарозном геле, выявление ДНК с помощью этидиум бромида
-
Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр (блот) Обработка нитроцеллюлозного фильтра радиоактивным зондом Выявление специфических полос ДНК с помощью авторадиографии
-
РЕПЛИКАЦИЯ И ТРАНСКРИПЦИЯ
-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И БЕЛКИ СИНТЕЗИРУЮТСЯ ПО МАТРИЧНОМУ ПРИНЦИПУ
РЕПЛИКАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИЯ ТРАНСЛЯЦИЯ ДНК РНК БЕЛОК ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ
-
Репликация
Репликация – это процесс самовоспроизведения генетического материала (в клетках – ДНК, у вирусов – ДНК или РНК)
-
Матричная функция ДНК при репликации
При репликации ДНК двойная спираль расплетается, и каждая нить служит матрицей для синтеза новой комплементарной нити по принципу Уотсона-Крика (А-Т, G – C)
-
Репликация всех двунитевых ДНК полуконсервативна
При репликации молекулы ДНК образуются две дочерние двунитевые молекулы. В каждой дочерней молекуле одна нить происходит из материнской молекулы, а вторая – вновь синтезированная нить.
-
Консервативный механизмрепликациинеизвестен
При консервативном механизме должны образоваться две двунитевые молекулы, одна из которых была исходной, а вторая состоит из двух вновь синтезируемых цепей.
-
Точки начала репликации (ori)
Репликация начинается в определен-ных точках молекулы ДНК В молекуле ДНК может быть одна, две (прокариоты, вирусы, плазмиды) или множественные (у эукариот) точки начала репликации
-
Инициация репликации
Инициация синтеза ДНК всегда требует наличия олигонуклеотида- праймера Праймером обычно служитолигорибонуклеотид 5’ 3’ 5’ 3’ праймер Растущая цепь ДНК
-
Направление репликации
От 5’– к 3’– концу растущей цепи От 3’– к 5’– концу матрицы 3’ 5’ 5’ 3’
-
Субстрат для матричного синтеза нуклеиновых кислот
Субстратом для синтеза НК служат нуклеозидтрифосфаты – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) для синтеза ДНК, рибонуклеозидтрифосфаты (NTP) для синтеза РНК
-
Структура нуклеозидтрифосфата
-
Полимеризация нуклеотидов
NMP+dNTP NMPdNMP + PP NMPdNMP + dNTPNMPdNMPdNMP +PP NMPdNMPdNMP +dNTP NMPdNMPdNMPdNMP + PP фосфодиэфирная связь 3’C-OH+ PPP-O-C5’ 3’C-O – P – O-C5’ + PP
-
Скорость репликации
У прокариот – около 1500 н/сек (геном E.coli – 4х106пн - реплицируется примерно за 40 мин) У эукариот – около 10-100 пн/сек, но много точек инициации
-
Рост цепей
Рост синтезируемой цепи всегда происходит от 5’-конца к 3’-концу. Рост лидирующей цепи - непрерывный. Рост отстающей цепи – прерывистый, фрагментарный, импульсный.
-
Репликативная вилка
5’ 3’ 5’ Отстающаяцепь Лидирующаяцепь 5’ Репликативн-ый комплекс
-
Фрагменты Оказаки
Отстающая цепь собирается из фрагментов Оказаки. Их длина: У прокариот – 1000-2000 нуклеотидов У эукариот – 100-200 нуклеотидов
-
Ферментативный аппарат репликации
Праймазы ДНК-полимеразы ДНК-лигазы ДНК-хеликазы ДНК-топоизомеразы ДНК-азы РНКазы Белки, связывающиеся с однонит. ДНК
-
Праймазы и праймосомы
Праймазы – РНК-полимеразы, синтезирующие короткие цепочки РНК, выполняющие роль праймеров (длина 2-7 н., иногда до 20-30 н.) Праймосомы - мультибелковые комплексы, содержащие праймазу и способные перемещаться по матрице, синтезируя праймеры
-
ДНК-полимеразы
Это главные ферменты репликации, полимеризующие дезоксирибонуклеотиды на матрице ДНК Они присутствуют во всех клетках ДНК-полимеразы разных организмов могут существенно различаться, но имеют сходный механизм действия
-
ДНК- полимеразы E.coli
ДНК-полимераза I (Pol I) (фермент Корнберга) ДНК-полимераза II (Pol II) ДНК-полимераза III (Pol III) – главная полимераза (состоит из 10 субъединиц)
-
А.Корнберг – ДНК-полимераза I
-
ДНК-полимераза Pol I
ДНК-полимеразная активность 5’3’ экзонуклеазная активность (коррекция ошибок) 5’3’ экзонуклеазная активность (удаление РНК-праймеров)
-
Процессивность полимераз
Процессивность – это способность молекулы полимеразы, передвигаясь по матрице, синтезировать полную цепь комплементарной ДНК Процессивная полимераза перемещается от 3’-конца матрицы к ее 5’-концу
-
Удаление праймеров и сшивание фрагментов Оказаки
ДНК-полимераза I удаляет РНК-праймеры из отстающей цепи и заполняет бреши между фрагментами Оказаки ДНК-лигазы соединяют фрагменты Оказаки в единую цепь, используя энергию АТФ
-
ДНК-хеликазы и топоизомеразы
Для репликации необходимо раскручивание двунитевой ДНК Хеликазы раскручивают двунитевую ДНК, участвуют в образовании репликативной вилки Топоизомеразы снимают сверх-спирализацию раскручиваемой молекулы ДНК, внося разрыв в одну или обе нити, а затем сшивая разрывы.
-
Репликация кольцевой ДНК
катенанты
-
Репликация по типу катящегося кольца
-
Особые случаи репликации
Репликация РНКРНК (РНК-содержащие вирусы) Репликация РНК– ДНК– РНК (ретровирусы) Репликация ДНК– РНК – ДНК (гепаднавирусы) Репликация ДНК аденовирусов
-
Экспрессия генов –
это процесс реализации информации, закодированной в ДНК, на уровне РНК и белков Транскрипция Трансляция
-
Транскрипция -
это перенос информации с ДНК на РНК по принципу Уотсона-Крика. Другими словами, это синтез РНК на матрице ДНК.
-
Химия синтеза РНК
Праймер не требуется Матрица – нить ДНК Субстрат – рибонуклеозидтрифосфаты (U,C,A,G) Комплементарные взаимодействия А-U, G-C Ферментативный аппарат – РНК-полимераза Между нуклеотидами образуется фосфодиэфирная связь
-
-
ДНК-зависимая РНК-полимераза
В клетках прокариот один тип РНК-полимеразы В клетках эукариот три типа РНК-полимеразы:I, II, III
-
ДНК-зависимые РНК-полимеразыэукариот
РНК-полимераза I синтезирует рибосомальную РНК (рРНК) РНК-полимераза II синтезирует матричную (информационную) РНК (мРНК) РНК-полимераза III синтезирует транспортную (тРНК) и другие виды малых РНК (мяРНК, мцРНК)
-
Структура РНК-полимераз
Клеточные РНК-полимеразы состоят из нескольких субъединиц Некоторые вирусные полимеразы состоят из одного полипептида
-
РНК-полимераза Е.coli
Содержит 6 полипептидных субъединиц: α2ββ’σω α – функция неизвестна β - связывает и полимеризует NTP β’- связывается с ДНК-матрицей σ (сигма) – инициация синтеза РНК ω (омега)- функция неизвестна
-
Три этапа транскрипции
Инициация Элонгация Терминация
-
Промоторы
Это нуклеотидные последовательности в ДНК (гене), которые связываются с РНК-полимеразой и определяют инициацию транскрипции
-
Прокариотический промотор
5’TAGTG TATTGACA TGATAGAAGCACTCTAC TATATT CTCAATAACG 3’ -35 последов. 10 - последов. Прибнов бокс старт -1 +1
-
Виды промоторов
Конституитивные – работают постоянно Индуцибельные – включаются и выключаются по потребности Тканеспецифические – работают в определенных тканях и органах
-
Элонгация транскрипции
Рост цепи РНК от 5’ к 3’-концу Локальное расплетание двунитевой ДНК матрицы
-
Терминация транскрипции-1
Существуют последовательности в ДНК, которые являются терминаторами транскрипции. В этих точках синтез РНК прекращается, и нить РНК отделяется от матрицы.
-
Терминация транскрипции-2
ρ-белки – связываются с прокариотическими терминаторами транскрипции ρ-зависимые терминаторы ρ-независимые терминаторы Терминаторы транскрипции у эукариот
-
Регуляция транскрипции
Трансрегуляция – осуществляется белками Цис-регуляция – осуществляется регуляторными элементами, находящимися в ДНК (обычно вблизи гена)
-
Факторы транскрипции
- это белковые факторы, влияющие на транскрипцию. В эукариотических клетках тысячи таких факторов. В прокариотических клетках есть белки-репрессоры транскрипции.
-
Цис-регуляторные элементы
Промоторы – перед геном, ориентированы Операторы – между промотором и геном Энхенсеры – усиливают экспрессию, могут находиться на большом расстоянии от гена, не ориентированы Сайленсеры – подобны энхенсерам, но ослабляют транскрипцию Инсуляторы – располагаются между промотором и энхенсером, могут подавлять или усиливать активность гена
-
Посттранскрипционныйпроцессинг (модификация, обработка) РНК
мРНК у прокариот не процессируется мРНК у эукариот подвергается трем изменениям: Кэпирование – присоединение 7-метилгуанозинтрифосфата на 5’конец мРНК [5’]3’met7GpppCNNNNNNNNNNNNNNN 3’ 2. Полиаденилирование – добавление поли-А к 3’концу мРНК (поли-А “хвост“) 3. Сплайсинг
-
Кэп (cap)
m7Gppp + pppC____________ m7GpppC____________ 5’ 3’ 3’ 5’
-
Сплайсинг
В отличие от прокариотического гена эукариотический ген состоит из экзонов и интронов мРНК считывается со всего гена, но затем участки, соответствующие интронам, удаляются, а участки, соответствующие экзонам, объединяются в одну нить.
-
Экзонно-интронная структура эукариотического гена
промотор экзоны интроны терм. Ген мРНК сплайсинг Интронная РНК разрушается В цитоплазму
-
Процессинг рибосомальной и транспортной РНК
Рибосомальная РНК возникает в виде единой нити, а затем разрезается специфическими ферментами на большую (23 или 28S), среднюю (16 или 18S) и малую (5.8S и 5S) рРНК Транспортная РНК процессируется подобным образом
-
Функции белков
Структурная Ферментативная Регуляторная Транспортная Сократительная Рецепторная
-
Полипептиды
Полипептиды – это неразветвленные полимеры, построенные из мономеров – аминокислот (АК). Длина полимерной цепи вариирует от десятков до тысяч АК.
-
Максимальная длинамолекул биополимеров
ДНК – десятки миллионов нуклеотидов РНК – до 30000 нуклеотидов Полипептиды – тысячи аминокислот
-
Белки
Белки состоят из одной или нескольких полипептидных цепей, принимающих определенную конформацию (трехмерную структуру).
-
Аминокислоты
Белки всех живых существ (от вирусов до человека) построены из 20 L-α-аминокислот.Редкие аминокислоты –селеноцистеин (Sec, U)и пирролизин (Pyl, O).
-
Структура α-АК
H O +H3N – C – C –O- R N-группа С-группа R-группа
-
Боковые (R) группы
H - Глицин (Gly, G) H +H3N – C – COO- H CH3 – Аланин (Ala,A) H +H3N – C – COO- CH3 CH2-R - все остальные АК
-
Гидрофобные неполярные АК
Аланин - СН3 COO- CH3 Пролин СН Валин - CH+H2N CH2 CH3 CH2 CH2 CH3 Лейцин - CH2-CH Изолейцин CH3-CH-CH2-CH3 CH3
-
Окси-АК
Серин -CH2-OH Треонин -CH-OH CH3
-
Дикарбоновые АКи их амиды
Аспарагиновая к-та –CH2-COO- Глютаминовая к-та -CH2-CH2-COO- Аспарагин – CH2-CONH2 Глютамин - CH2-CH2-CONH2
-
Основные АК
Лизин -CH2-CH2-CH2-CH2-NH3+ Аргинин --CH2-CH2-CH2–NH-C-NH3+ NH Гистидин –CH2-C = CH +HN NH CH
-
Ароматические АК
Фенилаланин - CH2- Тирозин - CH2- Триптофан -CH2- OH NH
-
Серосодержащие АК
Цистеин -CH2-SH Метионин - CH2-CH2 –S-CH3
-
Группы аминокислот
Гидрофобные неполярные АК Окси-АК Дикарбоновые АКи их амиды Основные АК Ароматические АК Серосодержащие АК Редкие аминокислоты (селеноцистеин, пирролизин)
-
Гидрофобность - гидрофильность
Гидрофобные – Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Cys, Tyr, Trp (10 AK) Гидрофильные - Gly, Ser, Thr, Asp,Asn, Glu, Gln, Lys, Arg, His (10 AK)
-
Полярность АК
Полярные – Gly, Ser,Thr, Tyr, Asp, Asn, Glu, Gln, His, Lys, Arg, Cys, Trp (13 AK) Неполярные АК – Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe (7AK)
-
Заряд
Кислые – Asp, Glu (-) Основные – Lys, Arg, His (+) Нейтральные – 15 АК
-
Мол. вес
Мелкие – Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Pro Средние – Leu, Ile, Glu, Gln, Asp, Asn, Met, Lys Крупные – His, Phe, Tyr, Trp, Arg
-
АК, составляющие полипептидную цепь, соединены между собой пептидными связями
-
Пептидная связь
Дипептид Н О Н +NH3- C – C-N –C – COO- R1 H R2 О Пептидная связь – C - N – (амидная группа) H
-
Длина полипептидов вариирует от 20 до нескольких тысяч АК Белки могут содержать от одной до 10-12 идентичных или разных полипептидных цепей Миоглобин – 1 цепь РНК-полимераза Е.coli – 6 цепей
-
Конформация белков
В водной среде белки принимают определенную трехмерную структуру (конформацию), зависящую от их аминокислотной последовательности Белки бывают глобулярными и фибриллярными Пример глобулярного белка – полимеразы Пример фибриллярного белка - коллаген
-
Уровни структуры белка
Первичная Вторичная Третичная Четвертичная Первые три относятся к полипептидной цепи, 4-я к олигомерным белкам, состоящим из двух и более цепей
-
Первичная структура белка
Первичная структура – это последовательность АК, связанных пептидными связями Каждый белок обладает уникальной аминокислотной последовательностью Для полипептидов длиной в 100 АК в принципе возможно 20100= 10130 вариантов
-
Вторичная структура
Образуется за счет водородных связей между амидными группами Альфа-спирали образуются за счет близлежащих амидных групп Бета-слои образуются за счет амидных групп разных цепей или удаленных районов одной цепи Неструктурированные участки полипептидной цепи
-
Альфа–спирали и бета–слои
-
Третичная структура
Структура, которую принимает полипептидная цепь в результате взаимодействия боковых цепей между собой и с водой Взаимодействия, определяющие третичную структуру: 1) водородные связи; 2) ионные связи; 3) гидрофобные взаимодействия; 4) образование ковалентной дисульфидной связи
-
Слабые взаимодействия между АК в пептидной цепи
Водородные связи – это взаимодействия между донорами (-ОН, -NH) и акцепторами водорода (=O, -O, -N=). -ОН---О= Ионные связи – это взаимодействия между положительными и отрицательно заряженными группами АК
-
Гидрофобные взаимодействия
Гидрофобные группы АК уходят от контакта с водой и прижимаются к другим гидрофобным группам Гидрофильные группы выходят наружу и образуют водородные связи с водой
-
Дисульфидная связь
Это ковалентная связь между двумя цистеинами -SH + SH- -S – S -
-
Третичная структура белка
-
Четвертичная структура
Она определяется взаимодействием двух или нескольких полипептидных цепей, которые входят в состав белка- олигомера Цепи объединяются за счет водородных, ионных, дисульфидных связей и гидрофобных взаимодействий. Объединение цепей специфично.
-
Гемоглобин
-
Первичная структура (т.е последовательность АК) обычно определяет остальные уровни структуры. Функциональная активность белка зависит от его конформации.
-
Денатурация и ренатурация белков
Денатурация белка – изменение его конформации под действием нагревания, повышенного или пониженного рН. При этом функцио-нальная активность белка исчезает Ренатурация – восстановление нормальной конформации и функции белка
-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И БЕЛКИ СИНТЕЗИРУЮТСЯ ПО МАТРИЧНОМУ ПРИНЦИПУ
РЕПЛИКАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИЯ ТРАНСЛЯЦИЯ ДНК РНК БЕЛОК ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ
-
Генетический код
Генетический код – это система кодирования порядка аминокислот в полипептидной цепи с помощью нуклеотидной последовательности ДНК и РНК Код был расшифрован в 1960-е годы
-
Особенности генетического кода
Триплетность – три нуклеотида (кодон) кодируют одну АК Избыточность – каждая АК кодируется двумя-шестью кодонами (только 2 АК кодируются одним триплетом) Отсутствие «запятых» между кодонами Значение нуклеотидов в кодоне: 2-й>1-й >3-й
-
Универсальность ГК
Генетический код одинаков для всех живых организмов Небольшие отклонения в генетическом коде обнаружены у простейших и в митохондриях Код содержит сигналы начала и окончания синтеза белка
-
Рамка считывания
В нуклеотидной последовательности в трехнуклеотидном коде существует три рамки считывания: CAT GGC GAC TAG CC His Gly Asp Stop ATG GCG ACT AGC C Met Ala Thr Ser TGG CGA CTA GCC Trp Arg Leu Ala
-
-
Участники процесса трансляции
мРНК тРНК Аминоацил-тРНК-синтетазы Рибосомы Белковые факторы трансляции Аминокислоты, ATP, GTP
-
Адапторный механизм трансляции
Молекулы транспортной РНК (тРНК), несущие специфическую АК и распознающие кодоны, являются адапторами, расшифровывающими генетический код. Нуклеотидный триплет(кодон) распознается комплементарным триплетом (антикодоном) тРНК
-
тРНК
В клетке существует несколько десятков видов тРНК Каждая молекула тРНК связывается с одной определенной АК Для каждой АК существует несколько видов тРНК
-
Структура тРНК
-
-
Структура тРНК3
-
Аминоацилирование тРНК
Аминоацил-тРНК-синтетазы являются ключевым элементом, обеспечивающим соединение «правильной» АК с «правильной» тРНК Аминоацил-тРНК-синтетаза тРНК +АК+ АТР АК-тРНК +АDP +NH3-CH-C-O- + PPP-A +NH3-CH-C-O- PO3 + PP-A R O R O 2) +NH3-CH-C-O- PO3 + OH(3’)ACC(5’) +NH3-CH-C-O- ACC5’ + R O R O PO4
-
-
Этапы синтеза полипептида на матрице мРНК у прокариот
Инициация (факторы инициации IF-1,-2,-3, рибосома, мРНК - последовательность Шайн-Дельгарно, GTP,AUG- кодон, формил-метиониновая тРНК) Элонгация(факторы элонгации EF-Tu,EF-Ts,EF-G, рибосома, мРНК, GTP, аминоацил-тРНК) Терминация (факторы терминации RF-1,-2,-3, рибосома, терминирующие кодоны мРНК-UAA,UAG,UGA)
-
Инициация синтеза полипептидной цепи
-
Элонгация пептидной цепи
рибосома (Р- и А-участки рибосомы) мРНК аминоацил-тРНК факторы элонгации EF-Tu,EF-Ts,EF-G GTP
-
Стоп-кодоны
UAA UAG UGA
-
Полирибосома (полисома)
-
-
Посттрансляционная модификация полипептидов
Конформационные изменения Образование S-S связей Специфический протеолиз Гликозилирование Фосфорилирование Карбоксилирование Присоединение жирной к-ты Другие
-
Препроинсулинпроинсулининсулин
Нет комментариев для данной презентации
Помогите другим пользователям — будьте первым, кто поделится своим мнением об этой презентации.