Презентация на тему "Трансгенез. Животные"

Содержание

• 
  Слайд 1

  ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

  ТРАНСГЕНЕЗ. ЖИВОТНЫЕ.

  Лекция 7

• 
  Слайд 2

  Словарь

  • Зигота – тотипотентная диплоидная клетка, образующаяся в результате оплодотворения (слияния яйцеклетки и сперматозоида)
  • Бластоциста– зародышевый пузырек, ранняя (преимплантационная) стадия развития зародыша млекопитающих (в том числе человека
• 
  Слайд 3
  

  Что означает термин «трансгенные животные»?

• 
  Слайд 4
  

  humbio.ru

  Трофобласт– наружный клеточный слой бластоцисты млекопитающих, принимает участие в имплантации и формировании плаценты

  Синцитиотрафобласт – выполняет функцию всасывания питательных веществ из крови матери, вырабатывает ферменты, способствующие внедрению ворсин хориона в ткани матки

• 
  Слайд 5
  

  1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота) 2. Зигота делится надвое 3-4. Митотическое деление продолжается 5. Через 5-6 дней образуется бластоциста 6. Внутреннюю часть бластоцисты (ВКМ) помещают на питательную среду для получения стволовых клеток

• 
  Слайд 6
  

  Этапы получения трансгенных животных(до принятия решения об интродукции)

  • Создание и амплификация rДНК (кассета экспрессии+вектор)
  • Выбор и подготовка клеток-реципиентов для трансформации
  • Встраивание трансгена в геном клетки-реципиента
  • Отбор трансгенных организмов
  • Отбор трансгенных организмов, образующих трансгенные гаметы
  • Получение чистых линий
  • Оценка экспрессии гена
• 
  Слайд 7
  

  • В 1982 году Р.Д.Пальмитер с коллегами опубликовали фотографию, на которой рядом сидели две мыши. Одна из них была трансгенной, в ее ДНК встроили ген гормона роста крысы, другая была обычной мышкой.
  • Металлотионеин - белок, способный связывать двухвалентные металлы. Регулирует концентрацию в клетке микроэлементов (цинк и медь).
• 
  Слайд 8
  

  Схемы получения трансгенных животных

  Микроинъекция в зиготу микроинъекция чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку (зиготу)

  1. Создание и клонирование кассеты экспрессии составе вектора клонируется в E. Coli

  2. Получение одноклеточных зигот

  3. ВыделяниеrДНК, переведение в линеарную форму, инъецирование в пронуклеус зиготы.

  4. пересадка эмбрионов самкам-реципиентам

  5. отбор трансгенных животных, продуцирующих трансгенные гаметы

• 
  Слайд 9
  

  1. встроился ли трансген в геном?

  2. несут ли трансген гаметы?

  3. экспрессируется ли трансген?

  Основные проблемы

• 
  Слайд 10
  

  Схема введения генов и установления гомозиготной линии мышей с помощью микроинъекций

  MDR1- ген множественной лекарственной устойчивости

• 
  Слайд 11
  

  Схемы получения трансгенных животных

  Реконструкция эмбрионов с использованием ЭСК (эмбриональных стволовых клеток) микроинъекция чужеродной ДНК в ЭСК

  1. Получение культуры ЭСК

  2. Введение в ЭСК rДНК с селективных маркером (с помощью ретровирусов, электропорации, липосом)

  3. Получение бластоцист для микроинъекции

  4. Конструирование химерных эмбрионов

  5. Пересадка эмбрионов самкам-реципиентам

  6. отбор трансгенных животных, продуцирующих трансгенные гаметы

• 
  Слайд 12
  

  Инъекция в бластоцисту

• 
  Слайд 13

  Способы введения днк в культивируемые клетки животных

  • Рекомбинантные РНК-вирусы
  • Клетка с помощью рецепторов опознает вирусную оболочку.
  • Вирус внедряет в клетку РНК.
  • В клетке РНК с помощью ревертазы переписывается в ДНК
  • ДНК проникает в ядро соматической клетки.
  • ДНК встраивается в ДНК клетки.
  • Клетка синтезирует копии обновленного генома и мРНК.
  • Белки транслируются
  • РНК вируса одеваются вирусной оболочкой выходят из клетки, заражая новые поколения клеток.
  • Перенос генов с помощью вирусов (Эффективные векторы созданы на основе ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса осповакцины, вируса герпеса и др.)

• 
  Слайд 14
  

  Структура экспрессирующего вектора pKSV-10 для трансгенеза животных рисунок из книги Л.И. Патрушева Экспрессия генов, 2004

• 
  Слайд 15

  Способы введения днк в культивируемые клетки животных

  Перенос генов, опосредованный клеточными рецепторами основан на интернализации рецепторов в процессе эндоцитоза

• 
  Слайд 16
  

  Электропорация.

  Кратковременное (10 мксек-100 мсек) воздействие электрическим полем высокой напряженности (50-1500 V/см), вызывает локальное нарушение целостности мембран с образованием микропор (диаметр 20-120 нм), через которые заряженные молекулы, в том числе и ДНК, как линейная, так и суперскрученная, проникают внутрь клеток

• 
  Слайд 17

  Основные стратегии в трансгенезе животных. Внедрение в практику.

  Создание новых животных, с улучшенными качественными и количественными характеристиками

  (лосось с трансгеном гормона роста)

• 
  Слайд 18
  

  • Создание новых животноводческих пород, дающих продукты с повышенным содержанием некоторых компонентов (например, в Великобритании существует стадо коров, молоко которых подходит для приготовления сыра чеддер).
• 
  Слайд 19
  

  Создание животных, способных продуцировать несвойственные их виду белки (например, сообщалось о получении свиней, способных продуцировать интерферон человека).

• 
  Слайд 20
  

  Создание трансгенных животных, являющихся донорами при трансплантациях органов.

  (например, из стволовых эмбриональных клеток животных вырастили глаза и уши лягушки).

• 
  Слайд 21
  

  Получение геномных библиотек – полное собрание генома человека, распределенное по отдельным «томам» рекомбинантных молекул плазмид или фаговыхчастиц «в суперобложке» бактерии E.coli.

• 
  Слайд 22
  

  Схема получения геномной библиотеки. Метод дробовика

• 
  Слайд 23
  

  Схема получения библиотеки кДНК

• 
  Слайд 24
  

  ДНК-зонды

  ДНК-зонд (англ. DNA probe) – фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.

• 
  Слайд 25
  

  ДНК-зонды.

  Зонды с комплементарными концевыми последовательностями (molecularbeacons)

  Зонды с резонансным переносом энергии (LightCyclerassay)

  Концевые последовательности зонда комплементарны и образуют шпильки, что гасит свечение. Зонды, которые отжигаются на матрицу, разворачиваются, и флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные стороны - увеличивается свечение.

  Принцип метода в переносе энергии от одного флуорофора (на 3` конце первого зонда), ко второму флуорофору (на 5` конце второго зонда). При связывании зондов с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором.

• 
  Слайд 26
  

  Схема получения кДНК.

• 
  Слайд 27
  

  Генная терапия

  в генной терапии наследственных болезней применяют векторные системы на основе:

  • лентивирусов
  • аденовирусов
  • аденоассоциированных вирусов
  • ортопоксвирусов
  • герпесвирусов
  • РНК-вирусов, не относящихся к ретровирусам

• 
  Слайд 28
  

  Сравнение свойств генотерапевтических векторных систем

• 
  Слайд 29

  Словарь

  • Таргетинг (target - мишень) – изменение генов за счет гомологичной рекомбинации последовательностей, находящихся в хромосоме, с искусственно введенными в клетку последовательностями ДНК
  • Упаковывающая клетка – линия клеток, созданная для продуцирования (упаковки) вирусных частиц, не содержащих инфекционных нуклеиновых кислот.
• 
  Слайд 30
  

  Схема переноса генов с использованием ретровирусных векторов

  1. Клонирование гена в ДНК ретровирусного вектора в клетках E.coli.

  2. Перенос ДНК ретровирусного вектора в упаковывающие клетки.

  3.Формирование ретровирусных частиц и их выход в культу реальную среду.

  4. Трансдукция гена в составе ретровирусного вектора в клетки-мишени.

• 
  Слайд 31
  

  Методы модификации вирусов

  • физический таргетинг– покрытие вирусной частицы специальной оболочкой, изменяющей ее природный тропизм и делающей ее неузнаваемой для иммунной системы человека
  • генетическая модификация вируса – модификация белков оболочки вектора
  • транскрипциональныйтаргетинг– введение в трансген-экспрессирующую кассету специфических для данных тканей промоторных последовательностей.
• 
  Слайд 32
  
• 
  Слайд 33
  

  Успехи и неудачи генной терапии

  17 сентября 2000 г. в Университете Пенсильвании умер 17 летний Джесси Гелзингер, которого пытались вылечить от наследственного заболевания печени недостаточность орнитинтранскарбомилазы (OTCD).

  Он умер из-за гиперреакцииимунной системы на ввод в печень генно-инженерного аденовируса.

  Смерть наступила вследствие острого респираторного синдрома и выхода из строя множества органов.

  Первая успешная попытка лечения тяжелого обычно несовместимого с жизнью наследственного иммунологического заболевания, вызванного дефектом в гене, кодирующем фермент аденозиндезаминазу, была осуществлена в 1990 г. В. Андерсеном с соавт.

  David Phillip Vetter

  21.09.1971, - 22.02.1984

  Джесси Гелзингер