Презентация на тему "Экспрессия рекомбинантных генов в эукариотических клетках"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Экспрессия рекомбинантных генов в эукариотических клетках

• 
  Слайд 2

  Про- и эукариотические клетки (схема)

• 
  Слайд 3

  Недостатки прокариотических систем

  Невозможность экспрессии интронированных эукариотических генов из-за отсутствия сплайсинга у прокариот Невозможность правильной пострансляционной модификации белков (протеолиз, фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование и др.) Нестабильность многих чужеродных белков в прокариотах

• 
  Слайд 4
  

  Эукариотические клетки, используемые как продуценты рекомбинантных белков

  Дрожжи (пекарские дрожжи, метило-трофные дрожжи) Культуры клеток насекомых Культуры клеток млекопитающихи птиц

• 
  Слайд 5

  Преимущества эукариотических клеток

  Обеспечивается правильное посттрансляционное процессирование рекомбинантных белков, особенно в клетках животных Дрожжи сочетают достоинства эукариотических и прокариотических клеток

• 
  Слайд 6

  Недостатки эукариотических клеток

  Использование эукариотических клеток, особенно клеток животных, менее технологично из-за более медленного размножения клеток и требует больших затрат Время удвоения: Бактерии – 20-30 мин Дрожжи – 1,5-2,5 ч. Клетки животных – 8-12 ч.

• 
  Слайд 7

  Пекарские дрожжи-Saccharomyces cerevisiae

  Размер клетки ~10 мкм Геном 1.4x107пн 16 хромосом Размножается почкованием и половым способом Время удвоения – 1,5-2,5 ч. Образует колонии на агаре, легко культивируется в биореакторах

• 
  Слайд 8

  Векторы для дрожжевой системы

  Вирусы дрожжей не описаны Обнаружен один вид плазмиды – 2 мкм ДНК На основе этой плазмиды получены векторы для дрожжей, в том числе челночные плазмиды

• 
  Слайд 9

  Челночный вектор

  Способен размножаться и в бактерии и в эукариотической клетке Содержит два участка ori – про- и эукариотический Содержит селективные маркеры для прокариотических и для эукариотических клеток

• 
  Слайд 10

  Челночный вектор для дрожжей

• 
  Слайд 11

  Векторы на основе ARS элементов

• 
  Слайд 12

  Трансфекция дрожжевых клеток

  Клетки дрожжей имеют полисахаридную клеточную стенку, окружающую цитоплазматическую мембрану. Эта стенка не пропускает молекулы ДНК. Клеточную стенку разрушают полисахарид-расщепляющим ферментом и получают сферопласты, которые обрабатывают CaCl2и трансфицируют ДНК. Клеточная стенка восстанавливается при культивировании.

• 
  Слайд 13

  Неинтегративная и интегративная трансформация

  Неинтегративная трансформация клетки достигается за счет размножения плазмиды в клеточном ядре. Интегративная трансформация – результат интеграции части плазмиды с интересующим геном в хромосому.

• 
  Слайд 14

  Стабильная и нестабильная трансформация клеток

  В отсутствие селективного давления автономные плазмиды легко утрачиваются (нестабильная трансформация) Интегрированный ген обычно стабильно сохраняется в геноме, если не влияет негативно на жизнеспособность клетки (стабильная трансформация)

• 
  Слайд 15

  Стабильная трансформация дрожжевых клеток

• 
  Слайд 16

  Искусственная дрожжевая хромосома (YAC)

• 
  Слайд 17

  Системы селекции для дрожжей

  Использование мутантов дрожжей, дефектных по генам синтеза аминокислот (лейцин, гистидин, триптофан) и азотистых оснований. Маркерами являются гены LEU, HIS, TRP, URA и др. Использование гена NEO устойчивости к антибиотику G418 (генетицину)

• 
  Слайд 18
  

  Регуляторные элементы, контролирующие эукариотические рекомбинантные гены

  ATG TC Poly-A signal Промотор AAAAA мРНК Полипептид

• 
  Слайд 19

  Регуляторные элементы для экспрессии генов в прокариотах

  P O SD ATG Gene TC TT мРНК Полипептид

• 
  Слайд 20

  Дрожжевые промоторы

  Промотор гена CYC1 (кодирует цитохром С) Промотор гена алкоголь-оксидазы (AOX1)

• 
  Слайд 21

  Метилотрофные дрожжи

  Метилотрофные дрожжи используют метиловый спирт в качестве источника углерода Они накапливаются в большом количестве Удобны для наработки рекомбинантных белков под контролем промотора гена алкоголь-оксидазы (АОХ1)

• 
  Слайд 22
  

  Использование метилотрофных дрожжей Pichia pastoris для наработки белков

• 
  Слайд 23
  

  Стабильная трансформация метилотрофных дрожжей плазмидой, содержащей ген HBsAg

• 
  Слайд 24

  Рекомбинантные продукты, полученные в дрожжевых системах

  HBsAg (вакцина против гепатита В) Белки малярийного плазмодия Оболочечный антиген HIV Лекарственные белки человека (эпидермальный фактор роста, альфа1-антитрипсин, факторы свёртываемости крови и др.)

• 
  Слайд 25

  Клетки животных в культуре

  Первичные и вторичные культуры Диплоидные штаммы клеток Перевиваемые линии клеток

• 
  Слайд 26

  Векторы для клеток животных

  Вирусы (поксвирусы, аденовирусы, полиома- и папилломавирусы, ретровирусы, бакуловирусы и др.) Прокариотические плазмиды

• 
  Слайд 27

  Схема плазмидного вектора для клеток млекопитающих

• 
  Слайд 28

  Введение плазмидных векторов в клетки

  Кальций-фосфатный метод (CaCl2+ Na3PO4 Ca3(PO4)2 Полибрен, ДЕАЕ-декстран Липосомы Электропорация Бомбардировка частичками золота

• 
  Слайд 29

  Селекция трансформированных клеток

  Ген устойчивости к G418 (генетицину) Ген устойчивости к пуромицину Устойчивость к аминоптеринуили метотрексату Устойчивость к микофеноловой кислоте Окраска (lacZ) или флуоресценция (флуоресцентные белки)

• 
  Слайд 30

  Транзиторная экспрессия генов в эукариотических клетках

  В большинстве трансфицированных клеток происходит транзиторная (временная, проходящая) экспрессия трансфицированного гена, достигающая максимума через 2-3 дня и спадающая к 6-7 дню после трансфекции. Небольшая часть трансфицированных клеток становится стабильно трансформированной.

• 
  Слайд 31

  Стабильная трансформация клеток животных рекомбинантными плазмидами

  Попав в клеточное ядро, рекомбинантные плазмиды способны встраиваться в геном клетки, что ведет к стабильной трансформации Встройка обычно происходит по принципу случайной рекомбинации Существуют способы увеличения числа копий встроенного гена

• 
  Слайд 32
  

  Использование гена дигидрофолатредуктазы для усиление экспрессии целевого гена

• 
  Слайд 33

  Увеличения числа копий введенного гена

  Выращивание клеток в присутствии аминоптерина ведет к амплификации участка генома, содержащего ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР) и прилежащие гены При этом резко увеличивается число копий гена ДГФР и расположенных рядом с ним генов. Количество продукта значительно увеличивается.

• 
  Слайд 34

  Эритропоэтин

  Важное лекарство – эритропоэтин – было получено в клетках СНО после амплификации гена эритропоэтина, встроенного рядом с геном ДГФР

• 
  Слайд 35

  Геном вируса SV40

• 
  Слайд 36

  Размножение плазмид в клетках животных

  Обезьяньи СOS клетки Я.Глузмана Эти клетки продуцируют Т антиген вируса SV40 T антиген, связываясь с ori SV40, вызывает репликацию вирусной ДНК клеточной репликационной машиной Если ori SV40 включен в плазмиду, она будет реплицироваться в COS клетках

• 
  Слайд 37

  Бакуловирусная система

  Вирус множественного ядерного полиэдроза – ДНК-содержащий вирус с кольцевой дцДНК ~120 тпн, поражает насекомых свыше 30 видов, вызывает образование полиэдров в ядрах клеток Полиэдры построены из вирусного белка полиэдрина. Ген полиэдрина имеет мощный промотор

• 
  Слайд 38

  Плазмидный бакуловирусный вектор

• 
  Слайд 39

  Получение рекомбинантного бакуловируса

  Клетки заражают «диким» бакуловирусом Трансфицируют зараженные клетки плазмидой, содержащей участок вирусной ДНК и ген интереса В результате гомологичной рекомбинации ген интереса встраивается в вирусную ДНК Затем отбирают и клонируют рекомбинантные вирионы методом бляшек

• 
  Слайд 40

  Встройка целевого гена в бакуловирусную ДНК

• 
  Слайд 41

  Получение рекомбинантного белка в бакуловирусной системе

  Культуру клеток насекомых заражают рекомбинантным бакуловирусом Целевой белок образуется в заражённых клетках и может быть выделен и очищен из культуральной жидкости или клеточного экстракта

• 
  Слайд 42

  Рекомбинантные белки, полученные в бакуловирусной системе

  В системе получены сотни рекомбинантных белков различного назначения Недавно была разработана вакцина против папилломавирусных инфекций, вызывающих рак шейки матки (антигены для этой вакцины нарабатываются в бакуловирусной системе)

• 
  Слайд 43

  Трансгенные животные

• 
  Слайд 44

  Биологические системы, используемые молекулярной биотехнологией

  Вирусы Прокариоты Дрожжи Культура клеток животных и человека (клетки насекомых, птиц, млекопитающих), растений Животные Растения

• 
  Слайд 45

  Трансгенные животные

  Трансгенные животные - это животные, в геном которых искусственно встроен чужеродный генетический материал Чужеродный ген содержится во всех клетках трансгенного организма

• 
  Слайд 46

  ТРАНСГЕНЫ И ТРАНСГЕНЕЗ

  ТРАНСГЕНЫ: ВСТРОЕННЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ОБОЗНАЧАЕТСЯ ТЕРМИНОМ “ТРАНСГЕН” ТРАНСГЕНЕЗ: ПРОЦЕСС ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ ОБОЗНАЧАЕТСЯ ТЕРМИНОМ “ТРАНСГЕНЕЗ”

• 
  Слайд 47

  Подготовка генной конструкции для трансгенеза

  Экспрессирующие векторы (плазмиды) – такие же, как для экспрессии генов в клетках животных. Они должны содержать регуляторные элементы (промоторы, энхенсеры и др.), соответствующие поставленной задаче Специальные конструкции для введения гена в заданную область генома

• 
  Слайд 48
  

  Регуляторные элементы, контролирующие эукариотические рекомбинантные гены

  ATG TC Poly-A signal Промотор AAAAA мРНК Полипептид

• 
  Слайд 49

  Стабильная трансформация клеток животных трансгеном

  В качестве трансгенов используют линейную ДНК, освобожденную от плазмидных последовательностей Попав в клеточное ядро, трансгены способны встроиться в геном клетки, что ведет к стабильной трансформации трансфицированной клетки Встройка обычно происходит по принципу случайной (негомологичной) рекомбинации

• 
  Слайд 50

  ВИДЫ ЖИВОТНЫХ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ТРАНСГЕНЕЗА

  ДРОЗОФИЛЫ ЗЕМНОВОДНЫЕ МЫШИ КРОЛИКИ КОЗЫ ОВЦЫ СВИНЬИ КОРОВЫ КУРЫ РЫБЫ

• 
  Слайд 51

  ОБЩАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

  ПОЛУЧЕНИЕ ОПЛОДОТВОРЕННЫХ ЯЙЦЕКЛЕТОК ВВЕДЕНИЕ КЛОНИРОВАННОГО ГЕНА В ЯДРО ОПЛОДОТВОРЕННОЙ ЯЙЦЕКЛЕТКИ ИМПЛАНТАЦИЯ ТАКИХ ЯЙЦЕКЛЕТОК В МАТКУ ПОДГОТОВЛЕННОЙ САМКИ ВЫЯВЛЕНИЕ ЖИВОТНЫХ, СОДЕРЖАЩИХ ТРАНСГЕН, СРЕДИ РОДИВШЕГОСЯ ПОТОМСТВА СКРЕЩИВАНИЕ ОСОБЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ТРАНСГЕН, ДЛЯ ВЫВЕДЕНИЯ ЛИНИИ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

• 
  Слайд 52

  Введение трансгена

  Введение трансгена с помощью ретровируса Микроинъекции трансгена в яйцеклетку, микроманипуляторы

• 
  Слайд 53

  ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ

  ПОЛУЧЕНИЕ ОПЛОДОТВОРЕННЫХ ЯЙЦЕКЛЕТОК ОТ СУПЕРОВУЛИРОВАН-НЫХ САМОК (ДО 35 ЯЙЦЕКЛЕТОК ВМЕСТО ОБЫЧНЫХ 5-10) МИКРОИНЪЕКЦИЯ ТРАНСГЕНА В МУЖСКОЙ ПРОНУКЛЕУС ИМПЛАНТАЦИЯ ИНОКУЛИРОВАННЫХ ЯЙЦЕКЛЕТОК В МАТКУ ПОДГОТОВЛЕННЫХ САМОК ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ПОТОМСТВА НА НАЛИЧИЕ ТРАНСГЕНА (БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИЯ И ПЦР)

• 
  Слайд 54

  Получение трансгенных мышей

• 
  Слайд 55

  ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ (ЭС) КЛЕТКИ

  ЭС КЛЕТКИ – НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ, ДАЮЩИЕ НАЧАЛО ВСЕМ ТКАНЯМ ОРГАНИЗМА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ ВВЕДЕНИЕ ТРАНСГЕНА В ЗАДАННОЕ МЕСТО ГЕНОМА

• 
  Слайд 56

  ПОЛУЧЕНИЕ ЭС КЛЕТОК

  ЭС КЛЕТКИ ПОЛУЧАЮТ ИЗ ВНУТРЕННЕЙ КЛЕТОЧНОЙ МАССЫ БЛАСТОЦИСТА КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЭТИХ КЛЕТОК ПОЗВОЛЯЕТ ПОЛУЧИТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

• 
  Слайд 57

  Источник стволовых клеток

• 
  Слайд 58

  ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭС КЛЕТОК ДЛЯ ТРАНСГЕНЕЗА

  ПОДГОТОВКА ЭС КЛЕТОК ТРАНСФЕКЦИЯ ЭС КЛЕТОК ТРАНСГЕНОМ, ОТБОР ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ВВЕДЕНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТРАНСГЕНОМ ЭС КЛЕТОК В БЛАСТОЦИСТЫ ИМПЛАНТАЦИЯ БЛАСТОЦИСТОВ ПОДГОТОВЛЕННЫМ САМКАМ ПОЛУЧЕНИЕ ПОТОМСТВА И ЕГО АНАЛИЗ НА НАЛИЧИЕ ТРАНСГЕНА

• 
  Слайд 59

  Введение трансгенов в ЭС клетки

  Кальций-фосфатный метод CaCl2+ Na3PO4 Ca3(PO4)2 Полибрен, ДЕАЕ-декстран Липосомы Электропорация

• 
  Слайд 60

  Получение трансгенных мышей с помощью стволовых клеток

• 
  Слайд 61

  ВВЕДЕНИЕ ТРАНСГЕНА В ЗАДАННОЕ МЕСТО ГЕНОМА

  ОБЫЧНО ТРАНСГЕН НЕ ИМЕЕТ ОПРЕДЕЛЕННОГО АДРЕСА ДЛЯ ВСТРОЙКИ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ТРАНСГЕНА В ЗАДАННЫЙ УЧАСТОК ГЕНОМА ИСПОЛЬЗУЮТ ПРИНЦИП ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ

• 
  Слайд 62

  ГЕН ТИМИДИНКИНАЗЫ (tk) ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

  TK ГЕНЫ ФОСФОРИЛИРУЮТ ТИМИДИН, ПРЕВРАЩАЯ ЕГО В ТМР (TdR TdR-PO4) TK ГЕН ВПГ ОТЛИЧАЕТСЯ НИЗКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ И СПОСОБЕН ФОСФОРИЛИРОВАТЬЦИТИДИН И «НЕПРАВИЛЬНЫЕ» НУКЛЕОЗИДЫ (НАПРИМЕР, ГАНЦИКЛОВИР). ФОСФОРИЛИРОВАННЫЙ ГАНЦИКЛОВИР УБИВАЕТ КЛЕТКУ

• 
  Слайд 63

  Целенаправленная встройка трансгенаГомологичная рекомбинация

• 
  Слайд 64

  Целенаправленная встройка трансгенаСлучайная рекомбинация

• 
  Слайд 65

  Позитивная и негативная селекция

  Ген ИнгибиторРостклеток (позитивная селекция) Neo - G418- Neo + G418 + (негативная селекция) tk HSV - ганцикловир + tk HSV+ ганцикловир -

• 
  Слайд 66

  ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

  ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНОВ ПОИСК ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОМОТОРОВ

• 
  Слайд 67

  НОКАУТ ГЕНОВ У МЫШЕЙ

  Нокаут гена – это его инактивация во всех клетках организма Это достигается встройкой маркерного гена внутрь нокаутируемого гена

• 
  Слайд 68

  ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

  Выявление промоторов, способных экспрессироваться в строго определенных тканях (в поджелудочной железе, в мозгу, в молочной железе и т.д.) Поставив онкоген под соответствующий промотор, можно вызвать опухоли у трансгенных мышей в определенной ткани или органе

• 
  Слайд 69

  ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

  ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНОВ ПОИСК ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОМОТОРОВ СОЗДАНИЕ МОДЕЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА: БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА (ГЕН ПРЕДШЕСТВЕННИКА БЕТА-АМИЛОИДНОГО БЕЛКА) МЫШИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К ВИРУСУ ПОЛИОМИЕЛИТА

• 
  Слайд 70

  Болезнь Альцгеймера

  Накопление сенильных бляшек в синапсах нейронов Бляшки содержат амилоид бета (Аβ, 4кД) Ген предшественника Аβ кодирует белок- предшественник Аβ (АРР) Мутации в гене АРР ведут к накоплению Аβ Мыши, трансгенные по мутантному гену АРР, проявляют симптомы болезни и характерные патологические изменения

• 
  Слайд 71

  МЫШИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К ВИРУСУ ПОЛИОМИЕЛИТА

  Рецептор полиовируса отсутствует в клетках мышей, поэтому они нечувствительны к этому вирусу Мыши, трансгенные по гену рецептора полиовируса, чувствительны к нему и могут использоваться для контроля полиомиелитной вакцины вместо обезьян

• 
  Слайд 72

  ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

  ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНОВ ПОИСК ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОМОТОРОВ СОЗДАНИЕ МОДЕЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА МОДЕЛЬНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ ПО ПРОДУКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ)

• 
  Слайд 73

  ПРОДУКЦИЯ БАВ В МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

  МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА - ФАБРИКА ПО СИНТЕЗУ БЕЛКОВ (ДО 600 КГ/КОРОВА/ПЕРИОД ЛАКТАЦИИ). ГЛАВНЫЕ БЕЛКИ: АЛЬФА-S1-КАЗЕИН АЛЬФА-S2-КАЗЕИН, БЕТА-КАЗЕИН КАППА-КАЗЕИН ЛАКТАЛЬБУМИН

• 
  Слайд 74

  ПРОМОТОРЫ, СПЕЦИФИЧНЫЕ ДЛЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

  ГЕНЫ КАЗЕИНОВ И ЛАКТАЛЬБУМИНА ИМЕЮТ ПРОМОТОРЫ, СПЕЦИФИЧНЫЕ ДЛЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ГЕН, КОНТРОЛИРУЕМЫЙ ТАКИМ ПРОМОТОРОМ, ЭКСПРЕССИРУЕТСЯ ИЗБИРАТЕЛЬНО В МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЕГО БЕЛКОВЫЙ ПРОДУКТ ВЫДЕЛЯЕТСЯ В МОЛОКО, ОТКУДА ОН МОЖЕТ БЫТЬ ПОЛУЧЕН В ЧИСТОМ ВИДЕ

• 
  Слайд 75

  ТРАНСГЕННЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ

  КОЗЫ ОВЦЫ СВИНЬИ КОРОВЫ КУРЫ

• 
  Слайд 76
  

  НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ БЕЛКИ, ПОЛУЧАЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

  БЕЛОК ЖИВОТНОЕ ТКАНЕВОЙ АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА - КОЗА УРОКИНАЗА - КОЗА ФАКТОР IX СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ - ОВЦА ЛАКТОФЕРРИН - КОЗА КОРОВА ХИМОЗИН - ОВЦА

• 
  Слайд 77

  ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

  УСТОЙЧИВОСТЬ К ИНФЕКЦИЯМ, УСКОРЕНИЕ РОСТА (ГЕН ГОРМОНА РОСТА) ДРУГИЕ СВОЙСТВА

• 
  Слайд 78

  НАУЧНОЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

  ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ТРАНСГЕНА СОЗДАНИЕ МОДЕЛЕЙ НЕКОТОРЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ БЕЛКОВ УЛУЧШЕНИЕ СВОЙСТВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

• 
  Слайд 79

  ПЕРСПЕКТИВЫ

  СОЗДАНИЕ НОВЫХ ПОРОД СЕЛЬСКО-ХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ПОЛЕЗНЫМИ СВОЙСТВАМИ СУЩЕСТВЕННОЕ РАСШИРЕНИЕ АССОРТИМЕНТА БАВ, ПОЛУЧАЕМЫХ В ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

• 
  Слайд 80

  Трансгенные растения

• 
  Слайд 81
  

  это растения, в каждой клетке которых присутствует чужеродный ген (трансген), подготовленный методом генетической инженерии (рекомбинантной ДНК) получение трансгенных растений - трансгенез

• 
  Слайд 82

  Для чего нужны трансгенные растения?

  Устойчивость к вредителям (насекомым, вирусам, бактериям, грибкам) Устойчивость к гербицидам и пестицидам Устойчивость к стрессам Изменение качества пищи, окраски цветов Растения как биореакторы

• 
  Слайд 83

  Тотипотентность растительных клеток

  Многие типы растительных клеток способны дать начало полноценному растению, т.е. являются тотипотентными Такие тотипотентные клетки используются для введения в них чужеродных генов при получении трансгенных растений

• 
  Слайд 84

  Стабильная трансформация клеток растений трансгеном

  Трансгены вводят в растительные клетки, из которых затем можно получить растения. Попав в клеточное ядро, трансгены способны встроиться в геном растительной клетки, что ведет к ее стабильной трансформации. Трансген окажется в каждой клетке растения, полученного из трансформированной клетки. Встройка обычно происходит по принципу случайной (негомологичной)рекомбинации.

• 
  Слайд 85

  ОБЩАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

  ВВЕДЕНИЕ КЛОНИРОВАННОГО ГЕНА В ТОТИПОТЕНТНЫЕ РАСТИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ СЕЛЕКЦИЯ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ВЫРАЩИВАНИЕ РАСТЕНИЙ ИЗ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ВЫЯВЛЕНИЕ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ТРАНСГЕН СКРЕЩИВАНИЕ ОСОБЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ТРАНСГЕН, ДЛЯ ВЫВЕДЕНИЯ СТАБИЛЬНОЙ ЛИНИИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

• 
  Слайд 86

  Подготовка генной конструкции для трансгенеза

  Конструкция должна содержать нужный ген, поставленный под контроль соответствующих регуляторных элементов (промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования и др.) и быть пригодной для введения в растительную клетку

• 
  Слайд 87
  

  Регуляторные элементы, контролирующие эукариотические рекомбинантные гены

  ATG TC Poly(A)сигнал Промотор AAAAA мРНК Полипептид

• 
  Слайд 88

  Векторы для растительных клеток

  Растения не имеют собственных плазмид В качестве векторов, в принципе, могут использоваться вирусы растений (например, ДНК-содержащий вирус мозаики цветной капусты) Существует специальная система (Ti- плазмиды) для трансформации растений

• 
  Слайд 89

  Введение трансгена

  Введение трансгена в растительные клетки с помощью Ti-плазмид Введение трансгенов в протопласты растительных клеток

• 
  Слайд 90

  Agrobacterium tumefaciens

  Почвенная грамотрицательная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна вызывать опухоли (корончатые галлы) у многих растений За развитие опухолей отвечают Тi- плазмиды (150-250 тпн), содержащиеся в этих бактериях

• 
  Слайд 91

  Ti (tumor inducing) плазмиды (рTi)

  Типичная Ti-плазмида содержит: Область вирулентности (6-8 генов), необходимую для проникновения плазмиды из бактерии в растение Область Т-ДНК, содержащую гены синтеза растительных гормонов - ауксина и цитокинина, а также опинов – производных аргинина (нопалина, октопина) Оri (точка начала репликации в агробактерии)

• 
  Слайд 92

  Нопалиновая Тi-плазмида

• 
  Слайд 93

  Два типа регуляторных элементов в pTi

  Промоторы генов, локализованных в Т-ДНК, - эукариотические промоторы, распознаваемые РНК-полимеразой II. Эти гены имеют эукариотические сигналы полиаденилирования Остальные гены pTi имеют прокариотические промоторы и сигналы терминации транскрипции

• 
  Слайд 94

  Трансформация растения Ti-плазмидой

• 
  Слайд 95

  Т-плазмиды

  Плазмиды Е.coli, содержащие Т-ДНК из Тi-плазмиды, обозначаются как Т-плазмиды

• 
  Слайд 96

  Челночные Т-плазмиды для E.coli

  Содержат: Т-ДНК, содержащую правую и левую пограничные последовательности из Ti- плазмиды (~25 пн) Ori для репликации в E.coli и агробактерии Необходимые маркерные гены

• 
  Слайд 97

  Челночная Т-плазмида

• 
  Слайд 98

  Использование Т-плазмид

  Т-плазмиды могут использоваться: Для трансформации растительных клеток вместе с Тi-плазмидой (бинарный вектор) Для переноса встроенного в область Т-ДНК гена в рТi Для внесения чужеродного гена в протопласты растительных клеток

• 
  Слайд 99

  pT-вектор для E.coli

• 
  Слайд 100

  Введение трансгенов в протопласты растительных клеток

  Протопласты растительных клеток получают путем обработки целлюлазой – ферментом, разрушающим целлюлозную стенку клеток Электропорация Микроинъекции Бомбардировка частичками золота

• 
  Слайд 101

  Селективные маркерные гены

  Для селекции трансформированных растительных клеток используют свыше 10 различных генов. Это гены устойчивости к антибиотикам G418, гигромицину, блеомицину, бластицидину и др.

• 
  Слайд 102

  Репортерные гены

  Описано около 15 различных репортерных генов, используемых в растениях Ген бета-галактозидазы (LacZ) Гены люциферазы (из светлячка, из бактерий) Гены опинсинтетаз Ген хлорамфениколацетилтрансферазы

• 
  Слайд 103

  Разница между селективным и репортерным геном

  Селективный ген позволяет выращивать трансформированные клетки и подавлять рост нетрансформированных клеток Репортерный ген позволяет оценить активность промотора или отличить трансформированные клетки от нетрансформированных без подавления роста последних Ген может быть только селективным или только репортерным (LacZ) или совмещать оба варианта использования

• 
  Слайд 104

  Удаление маркерного гена

  Если трансгенное растение предназначено для сельскохозяйственного использования, маркерный ген удаляется генетическими методами (отбор и скрещивание)

• 
  Слайд 105

  Промоторы для экспрессии чужеродных генов в растениях

  35S промоторвируса мозаики цветной капусты 2. Промоторы генов опинов (нопалина, октопина) из рТi 3. Другие промоторы растительных генов

• 
  Слайд 106

  Проблема экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях

  Добавление энхансеров к 35S промотору Введение чужеродного гена в ДНК хлоропластов (в клетке около 10000 хлоропластных геномов) Модификация кодонов гена (замена кодонов на наиболее используемые) методом точечных мутаций

• 
  Слайд 107

  Введение точечных мутаций в клонированный ген

• 
  Слайд 108

  Создание устойчивости к насекомым-вредителям

  Для создания устойчивости к насекомым используют несколько генов: 1. Ген протоксина Bacillus thuringiensis 2. Ген ингибитора трипсина из коровьего горошка 3. Другие гены ингибиторов трипсина или амилазы

• 
  Слайд 109

  Вектор с геном инсектицидного токсина Bасillus thuringiensis

• 
  Слайд 110

  Т-плазмида, содержащая ген ингибитора трипсина

• 
  Слайд 111

  Создание устойчивости к вирусам

  Экспрессия гена капсидного вирусного белка в трансгенных растениях подавляет вирусную инфекцию Антисмысловые РНК подавляют вирусные гены

• 
  Слайд 112

  Антисмысловые РНК

  Это РНК, которые комплементарны мРНК данного гена Антисмысловая РНК считывается с противоположной нити ДНК P мРНК Антисмысловая РНК

• 
  Слайд 113

  Создание устойчивости к грибкам и бактериям

  Гены белков патогенеза (PR) активируются в ответ на бактериальную или грибковую инфекцию Экспрессия таких белков в трансгенных растениях повышает их устойчивость к инфекции Пример PR белков – хитиназа, разрушающая оболочку грибковых клеток Для защиты от бактериальной инфекции используют ген лизоцима фага Т4

• 
  Слайд 114

  Устойчивость к различным стрессам

  Окислительный стресс (ген супероксиддисмутазы) Солевой стресс (гены синтеза бетаина) Перезревание и размягчение плодов (подавление гена полигалактуроназы с помощью антисмысловой РНК): томаты FLAVR SAVR (flavor savеr) – 1-й лицензированный трансгенный продукт (1994)

• 
  Слайд 115

  Создание устойчивости к гербицидам

  Для повышения устойчивости к гербицидам: Повышают продукцию белка, повреждаемого гербицидом Уменьшают способность соответствующего белка связываться с гербицидом Повышают способность растения разрушать гербицид

• 
  Слайд 116

  Другие возможности трансгенных растений

  Изменение пигментации цветов (трансгенные розы, тюльпаны, гвоздики, хризантемы) Увеличение содержания лизина (в сое) Улучшение качества растительного масла Модификация вида и вкуса плодов -изменение цвета, повышение сладости (белок монеллин слаще сахара в 10000 раз)

• 
  Слайд 117

  Растения как биореакторы

  Растения можно использовать для накопления различных дефицитных белков (антител, вирусных белков для создания вакцин, биологически активных веществ животного и человеческого происхождения)

• 
  Слайд 118

  ТРАНСГЕННЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ РАСТЕНИЯ

  Создано свыше 50 трансгенных сельскохозяйственных растений, часть из них лицензировано Среди них наиболее практичные и широко используемые виды: соя, рис, картофель, томаты, кукуруза и др.

• 
  Слайд 119

  ПЕРСПЕКТИВЫ

  СОЗДАНИЕ НОВЫХ ВАРИАНТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ПОЛЕЗНЫМИ СВОЙСТВАМИ СУЩЕСТВЕННОЕ РАСШИРЕНИЕ АССОРТИМЕНТА БАВ, ПОЛУЧАЕМЫХ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ КАК БИОРЕАКТОРАХ

• 
  Слайд 120

  Коинтегративный вектор

• 
  Слайд 121

  Клеточная инженерия и клеточная биотехнология

• 
  Слайд 122

  ВОЗНИКНОВЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ И КЛЕТОЧНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

  КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК В БИОТЕХНОЛОГИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ С 1950-х гг. В 1960-е гг. БЫЛА СОЗДАНА ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ОБЪЕДИНЯЮЩИХ ГЕНОМЫ ДВУХ ТИПОВ КЛЕТОК ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕСАДКИ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

• 
  Слайд 123

  Клеточная биотехнология

  Использование клеточных культур для биотехнологических целей Получение полезных продуктов с помощью клеточных культур (вакцины, антитела, БАВ) Использование стволовых клеток в биотехнологии

• 
  Слайд 124

  КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

  - СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЁННЫХ КЛЕТОК НА ОСНОВЕ ИХ СЛИЯНИЯ ИЛИ ПЕРЕСАДКИ ЯДЕР

• 
  Слайд 125

  Антитела

  Особые белки(иммуноглобулины), возникающие в организме в ответ на введение антигена и способные специфически соединяться с этим антигеном in vitro и in vivo

• 
  Слайд 126

  Структура антитела(иммуноглобулин G)

• 
  Слайд 127

  Теории образования антител

  Индукционная теория П. Эрлиха Клональная теория Ф.М. Бернета

• 
  Слайд 128

  Индукционная теория(Пауль Эрлих)

  Если организм не встречался с данным антигеном, то антител к нему нет В ответ на введение антигена клетки начинают производить антитела нужной специфичности Антиген влияет на специфичность возникающих антител

• 
  Слайд 129

  Клональная теория (Фрэнк Макферлан Бернет)

  В эмбриональном периоде развития организма закладываются сотни тысяч клонов В-лимфоцитов, спонтанно образующих антитела разной специфичности Антиген лишь специфически вызывает размножение клеток тех клонов, которые вырабатывали антитела, способные с ним связываться

• 
  Слайд 130

  Поликлональные антитела

  Антиген обычно имеет несколько антигенных детерминант (эпитопов) Каждый эпитоп вызывает размножение определенного клона В-лимфоцитов и, следовательно, образование антител против этого эпитопа Таким образом, иммунная сыворотка против данного антигена обычно является поликлональной

• 
  Слайд 131

  Недостатки поликлональных антител

  Препарат поликлональных антител включает антитела разной специфичности, в том числе против неспецифических примесей Препараты поликлональных антител недостаточно стандартны

• 
  Слайд 132

  Моноклональные антитела

  КЕЛЕР И МИЛЬШТЕЙН (1975) разработали технологию получения МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

• 
  Слайд 133
  

  - это антитела, которые направлены против одного эпитопа данного антигена и вырабатываются одним клоном В-лимфоцитов

• 
  Слайд 134

  Mетоды выявления антител и антигенов

  Существует много различных методов выявления антител и антигенов (реакция преципитации и ее варианты, реакция связывания комплемента и др.) Наиболее широко используемый метод - ИммуноФерментный Анализ (ИФА), или Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

• 
  Слайд 135

  Иммуноферментный метод выявления антител (ELISA)

• 
  Слайд 136

  Получение мышиных моноклональных антител (МКА)

  Иммунизация животных антигеном Получение селезёночных В-лимфоцитов Слияние В-лимфоцитов с миеломными клетками Отбор гибридных клеток «В-лимфоцит-Миелома» на среде НАТ (ГАТ) Отбор клонов гибридных клеток, продуцирующих нужные антитела Накопление клеток и получение антител

• 
  Слайд 137

  Принцип получения моноклональных антител

• 
  Слайд 138

  Миеломные клетки

  Миеломы – опухоли из В-лимфоцитов Перевиваемые миеломные клетки выращивают в присутствии 8-азогуанина и получают клетки, дефектные по гену ферментаГипоксантинГуанинФосфо-РибозилТрансферазы (ГГФРТ, HGPRT) Такие клетки не растут на среде НАТ

• 
  Слайд 139

  Среда НАТ

  Это питательная среда, содержащая Гипоксантин+Аминоптерин (ингибитор дигидрофолатредуктазы, DHFR) +Тимидин HGPRT-и TK- клетки не растут на среде НАТ, так как не способны образовывать пуриновые нуклеотиды (HGPRT-) или тимидинмонофосфат (TK-)

• 
  Слайд 140

  Два пути образования GMP

  HGPRT Гипоксантин ---------- GMP DHFR Гипоксантин ----------- GMP

• 
  Слайд 141
  

  Варианты клеток, образующихся при слиянии В-лимфоцитов (Л) и миеломных клеток (М)

  Л(HPRT+)- не размножаются в культуре ЛЛ (HGPRT+) -- ” - M (HGPRT-) – не размножаются на среде НАТ ММ (HGPRT-) –- “ – LM (HPRT+) – размножаются на среде НАТ

• 
  Слайд 142

  Гибридомы

  Это опухоли, возникающие у мышей, привитых гибридными клетками «лимфоцит-миелома» При внутрибрюшинном введении гибридомных клеток возникают асцитные опухоли Асцит содержит антитела, продуцируемые гибридными клетками

• 
  Слайд 143

  Накопление МКА

  В культуре клеток В асците мышей с внутрибрюшинным ростом гибридомы МКА очищают из культуральной среды или из асцита методом аффинной хроматографии (колонки с протеин А- или протеин G-сефарозой)

• 
  Слайд 144

  Главные преимущества МКА

  Высокая специфичность Стандартность приготовления

• 
  Слайд 145

  Применение МКА

  Высокоспецифическое обнаружение антигенов в научных и диагностических исследованиях Очистка антигенов методом аффинной хроматографии Терапевтическое использование, иммунотоксины

• 
  Слайд 146

  Иммунотоксины

  Это комплекс из специфического МКА и токсина, который связывается с клетками, имеющими на поверхности антиген, против которого направлено данное антитело