Содержание
-
Анализ генной экспрессии на модели Mycoplasmagallisepticum.
Отчет о выполнении летней лабораторной практики. Лаборатория протеомного анализа НИИ ФХМ. ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России. Выполнил:студент 482 «Б» группы отделения биохимии МБФ Киселев Иван. 2011 г. Оглавление
-
Оглавление.
Информация о докладчике. Введение Морфология микоплазм. Культуральные особенности. Особенности культивирования микоплазм. Микоплазменная среда. Методики. Постановка цветового теста. Выделение РНК из культуры. Выделение геномной ДНК из культуры. Реакция обратной транскрипции. ПЦР в реальном времени. Результаты реакции. Электрофорез молекул ДНК в агарозном геле. Получение кинетики роста культуры в периодической среде. Приложение. Использованная литература. Источники изображений. Титульный слайд
-
Информация о докладчике.
Киселев Иван Сергеевич – студент медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России. Отделение – биохимия, 481 группа. e-mail: kiselev.ivan.1991@yandex.ru Работа выполнялась на базе лаборатории протеомного анализа НИИ физико-химической медицины (Москва, ул. Малая Пироговская, 1а). Оглавление
-
Введение.
Микоплазмы — самые мелкие из известных организмов с клеточной структурой, составляют класс Mollicutes и относятся к прокариотам. Научный интерес представляет ответ клетки микоплазмы на шоковое воздействие. Его можно проследить по изменению уровня экспрессии тех или иных генов по сравнению с нормой. Оглавление
-
Морфология микоплазм.
Клетки микоплазмне ограничены клеточной стенкой, но обладают более стабильной плазматической мембраной, модифицированной холестерином. Клетки одной и той же микоплазмы могут быть сферической (или вытянутой) формы 0,3 - 0,8 мкм в диаметре, могут образовывать длинные (до 100 мкм), иногда ветвящиеся тяжи. Коккоидные структуры иногда образуют кольцо. Оглавление
-
Культуральные особенности.
Культивирование микоплазмтребует приготовления сложных питательных сред, в состав которых входят дополнительные факторы роста. Микоплазмы не чувствительны к β-лактамным антибиотикам. Следовательно, рост посторонних бактерий можно достаточно легко подавлять. Колонии микоплазм при росте на плотной среде напоминают яичницу глазунью — непрозрачная центральная часть, погруженная в среду, и просвечивающая периферия в виде круга. Оглавление
-
Особенности культивирования микоплазм. Микоплазменная среда.
Для приготовления 1л среды: Добавить агар до 0,4% (на жидкую среду). Автоклавировать 20 минут при 1,2 атм и 121⁰С. После автоклавирования добавить: Для выращивания в подготовленную среду вносят старую культуру (10% от объема подготовленной среды). Микоплазма растет одни сутки при 37⁰С. Далее культуру можно использовать в работе или пересевать на новую среду. Оглавление Назад
-
Методики.
Цветовой тест (выяснение оптимальной дозы раздражителя) Выделение РНК из опытной и контрольной групп Выделение геномной ДНК (контроль) Обратная транскрипция ПЦР в реальном времени (определение уровня экспрессии) Электрофорез ДНК в агарозном геле Получение кинетики роста культуры на основе измерения количества ДНК. Дополнительно: Оглавление
-
Постановка цветового теста.
Готовят образцы: контроль и образцы, подвергнутые действию раздражителя в возрастающих количествах. Бактерии засевают в ряды пробирок так, что в каждой последующей пробирке культура разводится в 10 раз. Среда подкрашена индикатором, обесцвечивающимся при закислении. Оценивают скорость роста по обесцвечиванию индикатора. Выбирают два ряда, имеющих сходную с контролем скорость роста и подвергнутых действию раздражителя в максимальном объеме. Повторяют тест с более мелкой градацией объемов раздражителя. Выбирают ряд с максимально близкой к контролю скоростью роста и максимально большим объемом раздражителя. Оглавление
-
Выделение РНК из культуры.
В пробирку вносят культуральную жидкость, добавляют TRIzol LS. Встряхивают пробирку. Вносят хлороформ. Тщательно встряхивают. Инкубируют 15 минут при комнатной температуре и центрифугируют. Отобираютсупернатант, осаждают РНК и отмывают в этаноле. Ресуспендируют в дистиллированной воде. Оглавление
-
Выделение геномной ДНК из культуры.
В пробирку вносят культуральную жидкость и центрифугируют. Отобираютсупернатант. Ресуспендируютосадок в СТАВ-буфере (см. приложение). Инкубируют 10 минут при 60 ⁰ С Вносят в пробирку хлороформ. Тщательно перемешивают и центрифугируют. Отобираютсупернатант, осаждают ДНК и отмывают в этаноле. Ресуспендируют в дистиллированной воде. Оглавление
-
Реакция обратной транскрипции.
К раствору РНК приливают реакционную смесь для разрушения ДНК (см. приложение). Инкубировать 1,5 часа. К смеси добавить случайные праймеров (последовательность из шести случайных нуклеотидов). Инкубируют образец 5 минут при 80⁰С Переносят пробирку в лед для отжига праймеровна молекулах РНК. Вносят реакционную смесь для обратной транскрипции (см. приложение). Инкубируют 45 минут при 42⁰С. Оглавление
-
ПЦР в реальном времени.
Готовят реакционную смесь для ПЦР в реальном времени (см. приложение). В пробирки или ячейки 96-луночной плашки для ПЦР вносят праймер. В каждую пробирку или ячейку с праймеромвносят реакционную смесь и образец. Регистрируют кривую изменения интенсивности флуоресценции интерколирующего красителя (SYBR green). Оглавление
-
Результаты реакции.
Представление данных : Были выбраны гены, интенсивность экспрессии которых слабо зависит от воздействия раздражающего агента (gap, eno). Получено среднее арифметическое результатов прибора для этих генов. Вычислена разница между этим значением и результатом для каждого из проверяемых генов. Полученные разности (в количествах циклов) использовались для построения диаграммы. Оглавление
-
Электрофорез молекул ДНК в агарозном геле.
Готовят гель: ТАЕ-буфер, 1-1,5% агарозы (по массе) и бромистый этидий. Разогревают до гомогени-зации раствора. Заливают форму. Смешивают образцы с буфером на основе глицерина. Наносят образцы на гель и устанавливают напряжение из расчета около 10V на каждый сантиметр геля. За ходом фореза следят по смещению пятна красителя относительно начальной точки. Оглавление
-
Получение кинетики роста культуры в периодической среде.
Для получения кинетики роста культуры использовались замеры уровня экспрессии гена 16S рибосомальной РНК. Измерение проводилось с помощью реакции ПЦР. В качестве матрицы использовалась геномная ДНК и ДНК синтезированная с РНК в ходе реакции обратной ранскрипции. Оглавление
-
Приложение.
СТАВ-буфер На 100 мл. Реакционная смесь для разрушения ДНК (на 10 мг осадка). Реакционная смесь для обратной транскрипции(на 100 мкл раствора РНК). Реакционная смесь для ПЦР. Оглавление
-
Использованная литература.
Лабораторные методики, полученные от руководителя. http://ru.wikipedia.org/ Микробиология. Воробьев А.В., Быков А.С. 2003 г. Медицинская микробиология. Поздеев О.К. 2004 г. Оглавление
-
Источники изображений.
http://www.tophealth.ru/c/192/ATEROSKLEROZA-RESPUBLIKANSKIY-TSENTR-pri-NII-FHM-ROSZDRAVSOTSRAZVITIYA-RF.html http://koroleni.livejournal.com/163817.html http://immunar.ru/nauka/osobennosti-mikoplazmoza/ http://www.dntpasteur.ru/metodic5_1_2_1.php http://www.medclub.ru/disease/mycoplasmosis.html http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10296028 http://www.cellular-products.com/Molecular-biochemical-reagent/Nucleic-acid-Separation-and-Purification/Trizol-Reagent-/ www.qiagen.com/images/catalog/2349.jpg&w=370&h=464&ei=zPFLT5qPFafe4QTs1v http://www.nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/pages/2004/155.htm http://www.agrobiology.ru/6-2010krivtsov.html http://www.booksmed.com/mikrobiologiya/page/4/ http://www.booka.ru/books/13900/about http://ru.wikipedia.org/ Оглавление
Нет комментариев для данной презентации
Помогите другим пользователям — будьте первым, кто поделится своим мнением об этой презентации.