Презентация на тему "Полимеразная цепная реакция как инструмент современной биотехнологии"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Полимеразная цепная реакция как инструмент современной биотехнологии

  Л.И. Патрушев Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва

• 
  Слайд 2
  

  Кари Б. Муллис(KaryB. Mullis) – изобретатель полимеразной цепной реакции (ПЦР)

  Американский биохимик 1944 г.р. Патент - 1985 г., фирма Cetus Corp. California Нобелевская премия по химии – 1993 г.

• 
  Слайд 3
  
• 
  Слайд 4
  
• 
  Слайд 5
  
• 
  Слайд 6
  
• 
  Слайд 7

  Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл

• 
  Слайд 8

  Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл

• 
  Слайд 9

  Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР

• 
  Слайд 10

  Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов)

  a – начальная денатурация ДНК b – собственно реакция с – достройка цепей ДНК d – хранение 4°С

• 
  Слайд 11

  ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)

  После 6 циклов ПЦР образуется 64 идентичных копии исходного генетического локуса (ампликона)

• 
  Слайд 12

  Типичный результат амплификации ДНКс помощью ПЦР

  Ген фактора V системы свертывания крови человека (амплимер) Размер продукта – 174 п.о. 20 циклов ПЦР Электрофорез в 3% агарозном геле Окраска бромистым этидием M Ампликоны

• 
  Слайд 13

  Современный амплификатор

  Термостатируемая крышка Возможность использования 96-луночных плашек Градиент температуры вдоль нагревающего блока Возможность регуляции скорости перехода от одного сегмента цикла к другому (ramp time) «Терцик» фирмы ДНК-технология (Москва) – высококачественный отечественный амплификатор

• 
  Слайд 14

  Компоненты, необходимые для проведения ПЦР

  Объем пробы – 0,5-50 мкл Анализируемая ДНК – 50-100 нмолей, 0,1-0,25 мкг (до 1 молекулы в пробе) Термостабильная ДНК-полимераза 4 Дезоксирибонуклеозидтрифосфата (4 dNTPs –dATP, dGTP, TTP, dCTP) – 0,2 мМ Олигонуклеотидные праймеры – длина 17-25 н.т. (0,5-1,0 мкМ) Ионы Mg2+ - 0,5-3,0 мкМ Буферный раствор Все компоненты ПЦР производятся в ИБХ РАН

• 
  Слайд 15

  Структура и свойства Taq-ДНК-полимеразы

  Наличие 5’→3’ экзонуклеазной активности Отсутствие 3’ →5’ экзонуклеазной активности Высокая термостабильность (время полужизни: ~ 2 часа при 95С) Скорость синтеза ДНК ~ 50 нт/сек при 72С

• 
  Слайд 16

  Критические характеристики ПЦР, наиболее важные для исследователя

  Специфичность Точность синтеза ДНК Эффективность

• 
  Слайд 17

  Критические характеристики ПЦР: специфичность

  В неоптимальных условиях при амплификации образуются неспецифические продукты ПЦР (шмир, дополнительные полосы, в т.ч. димеры праймеров) Электрофорез в агарозном геле, окраска бромистым этидием,

• 
  Слайд 18

  ПЦР с «горячим стартом»

  Обратимая инактивация Taq-ДНК-полимеразы резко увеличивает специфичность ПЦР Добавление в реакционную смесь некоторых соединений (DMSO, бетаин, 2-пирролидон) приводят к тому же эффекту Амплификация гена tPA Обычная ПЦР ПЦР с горячим стартом» Уменьшение содержания ДНК в пробе >>>

• 
  Слайд 19

  Влияние концентрации праймеров на специфичность ПЦР

  Вверху указана концентрация праймеров

• 
  Слайд 20

  Влияние температуры отжига праймеров на специфичность ПЦР

  Амплификация части гена фактора V системы свертывания крови человека Температура ,°С

• 
  Слайд 21

  Точность синтеза ДНК некоторыми термостабильными ДНК-полимеразами

• 
  Слайд 22

  Методы ПЦР

• 
  Слайд 23

  Асимметричная ПЦР

  Амплификация с преимущественным использованием одного праймера Один из праймеров в меньшей концентрации В основном образуется одноцепочечный продукт ПЦР Линейное увеличение продукта ПЦР

• 
  Слайд 24
  

  Множественная ПЦР (Multiplex PCR) – одновременная амплификация нескольких ампликонов в одной пробирке

• 
  Слайд 25

  «Гнездовая» ПЦР (Nested PCR)

• 
  Слайд 26
  

  Амплификация больших участков ДНК с высокой точностью (Long PCR, LA PCR)

  Амплификация участков ДНК до 200 т.п.н.(целых эукариотических генов и вирусных геномов) Использование смесей из двух ДНК-полимераз, одна из которых обладает 3’→5’-экзонуклеазной активностью Использование высокоочищенных dNTPs

• 
  Слайд 27

  Иммуно-ПЦР (IPCR)

  ДНК-матрица конъюгирована с молекулами иммуноглобулинов, специфичных в отношении анализируемого антигена Конкурентная иммуно-ПЦР: конъюгат лиганда с ДНК-матрицей конкурирует со свободным лигандом за АТ 1000-Кратное увеличение чувствительности стандартного иммуноферментного метода

• 
  Слайд 28

  Случайная амплификация полиморфных последовательностей (метод RAPD)

  ATCTGGAGC Salmonella

• 
  Слайд 29

  ПЦР in situ: амплификация участков ДНК или РНК в интактных клетках

  Фиксация 10% формалином клеток и тканей, помещение в парафиновые блоки, пермеабилизация клеточных мембран протеиназами (пепсин), их удаление диэтилпирокарбонатом, амплификация с биотинилированными нуклеотидами, детекция Позволяет: Локализовать анализируемые последовательности во внутриклеточном пространстве Обнаруживать 1 копию последовательности на фоне 1 μg ДНК, т.е. уникальные гены и их транскрипты Находит широкое применение в вирусологии, онкологии и биологии развития

• 
  Слайд 30

  Недостатки ПЦР, проводимой в обычном формате

  Необходимость анализа продуктов ПЦР после завершения реакции Электрофорез Гибридизация и т.п. Опасность кроссконтаминаций продуктами ПЦР Невозможность количественной оценки содержания амплифицируемой матрицы в анализируемых образцах

• 
  Слайд 31
  

  Обычная ПЦР не позволяет определять количество матричной ДНК или РНК в пробе

  Ни одна из стадий ПЦР не завершается с эффективностью 100% Накопление ингибиторов ПЦР при прохождении реакции Наименее эффективны завершающие циклы Решение проблемы с помощью ПЦР в реальном времени

• 
  Слайд 32
  

  Количественная ПЦРПЦР в реальном времениReal-time PCRПозволяет, не открывая пробирки, непрерывно следить за накоплением продуктов ПЦР в пробах

• 
  Слайд 33

  Устройство капиллярного амплификатора LightCycler

  Капилляры объемом 20 мкл обеспечивают высокое соотношение поверхности к объему и высокую скорость теплообмена. 30 циклов завершаются за 20-30 мин

• 
  Слайд 34
  

  Российские производители амплификаторов для проведения ПЦР в реальном времени

  Институт аналитического приборостроения РАН, С-Петербург совместно с фирмой «Синтол», Москва Фирма «ДНК-Технология», Москва Флуоресцентно-меченые зонды – «ДНК-синтез», (ИБХ РАН), фирма «Синтол», Москва

• 
  Слайд 35

  Принцип действия зондов TaqMan

  5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель, который начинает флуоресцировать в реакционной смеси Флуорофор Гаситель флуоресценции

• 
  Слайд 36
  

  Принцип действия зондов, основанных на резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET - fluorescence resonance energy transfer)

• 
  Слайд 37
  

  Принцип действия зондов – молекулярных маяков (molecular beacon probes)

  В растворе зонды образуют структуру «стебель-петля», что приводит к сближению флуорофора и гасителя флуоресценции

• 
  Слайд 38

  Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времени

  Праймеры «Амплифлюр» Праймеры «Скорпион»

• 
  Слайд 39
  

  Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания реакции

  СT СT–пороговый цикл

• 
  Слайд 40

  Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в пробе

  Определение числа плазмидных копий гена F8в трансфицированных клетках человека Концентрация ДНК в крайних точках различается на 9 порядков

• 
  Слайд 41

  Цифровая ПЦР (Digital PCR)(на основе эмульсионной ПЦР)

• 
  Слайд 42

  Эмульсионная (эм)ПЦР на мирочастицах с иммобилизованным праймером

  Начало 1-го цикла эмПЦР Начало 2-го цикла эмПЦР Начало 3-го цикла эмПЦР эмПЦР Матрица оцДНК Синтезированная цепь ДНК Праймеры Гидрофобная фаза эмПЦР

• 
  Слайд 43
  

  Вторая стратегия получения полимеразных колоний в секвенаторах второго поколения

  Амплификация ДНК на твердой (стеклянной) подложке 1 2 3 4 Иммобилизация праймеров и матрицы на стекле ПЦР Молекулярные кластеры молекул ДНК Секвенирование

• 
  Слайд 44
  

  Стратегии получения полимеразных колоний в секвенаторах второго поколения

  Одна молекула ДНК/кластер Подготовка ДНК, 5 мкг ПЦР на стекле 100-200 млн молекулярных кластеров Рост кластеров Арочная амплификация

• 
  Слайд 45

  ПЦР в прикладных исследованиях

  ДНК-диагностика

• 
  Слайд 46

  Что такое «ДНК-диагностика»?

  Постановка диагноза заболевания или выявление предрасположенности к нему путем определения особенностей структуры генов (ДНК) обследуемого пациента

• 
  Слайд 47

  Геном человекав связи его болезнями

  Количество известных генов, ассоциированных с болезнями –>1500 (OMIM – Online Mendelian Inheritance in Man) Количество заболеваний, диагностируемых на генетическом уровне –>1000 Количество генетических тест-систем, используемых в современной клинике –>650

• 
  Слайд 48

  ДНК-полиморфизмы – основа генетической индивидуальности человека

  Полиморфизмы – это мутации с частотой >1% SNP – (single nucleotide polymorphisms) полиморфизмы по отдельным нуклеотидам – обнаружено в геноме человека – >10,000,000 Геномы двух людей различаются по ~1,500, 000 SNP, (1 SNP/180 п. н., исследовано 137 человек) CNV – copynumbervariation (различия в числе копий участков генома)

• 
  Слайд 49

  Поиск SNP в генах человека

  Поиск SNP в генах пациентов, ассоциированных с заболеваниями – одно из главных направлений современных медико-генетических исследований

• 
  Слайд 50

  Аллель-специфическая ПЦР

  Принцип действия аллель-специфических праймеров: Элонгация праймера происходит только в том случае, если его 3’-концевой нуклеотид комплементарен матричной ДНК

• 
  Слайд 51
  

  Выявление мутации FV Leidenв геноме человекас использованием аллель-специфической ПЦР

  Электрофорез продуктов ПЦР в 3% агарозном геле

• 
  Слайд 52
  

  ПЦР в реальном времени: принцип действия системы TaqManс аллель-специфическими зондами

• 
  Слайд 53
  

  Выявление мутации FV Leiden c помощью ПЦР в реальном времении аллель-специфических зондов

• 
  Слайд 54
  

  Будущее ДНК-диагностики –это высокопроизводительноепараллельное секвенирование ДНК