Презентация на тему "Трансгенез. Растения"

Содержание

• 
  Слайд 1

  ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

  ТРАНСГЕНЕЗ. РАСТЕНИЯ

  Лекция 6

• 
  Слайд 2

  Словарь

  • Экспрессия гена – появление в клетках организма-реципиента биологически активного генного продукта
  • Кассета экспрессии – фрагмент ДНК, содержащий все необходимые элементы (промотор, терминатор) для экспрессии внедренного в него гена
• 
  Слайд 3
  

  Причины внедрения в практику генетической инженерии растений

• 
  Слайд 4

  ТЕХНИКА ТРАНСГЕНЕЗА

  ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

• 
  Слайд 5
  

  Этапы получения трансгенных растений (до принятия решения об интродукции)

• 
  Слайд 6

  ЭТАП 1. ПОЛУЧЕНИЕ И АМПЛИФИКАЦИЯ rДНК(кассета экспрессии+вектор)

  ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

• 
  Слайд 7
  

  Кассета экспрессии

  Промотор + целевой ген (трансген) + терминатор

• 
  Слайд 8
  

  Промоторы для кассеты экспрессии.

  Классификация

  • КОНСТИТУТИВНЫЕ
  • СПЕЦИФИЧНЫЕ

  Обеспечивают экспрессию на протяжении всего срока жизни трансгенного организма

  Обеспечивают избирательную активность, например, экспрессию только в клубнях

  • ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ

  Активируются под воздействием определенных факторов (хим. в-в, температуры и др.)

• 
  Слайд 9
  

  Векторы для переноса и интеграции кассеты экспрессии. Основа

• 
  Слайд 10

  Агробактериальная трансформация. Ti- и Ri-плазмиды

  ЭТАП 1.

• 
  Слайд 11
  

  1980 г. М. Ван Монтегю и Д. Шелл открыли явление агробактеральной трансформации

  • Марк Ван Монтегю Джефф Шелл
  • Agrobacterium tumefaciens
  • Грамотрицательные аэробы, почвенные микроорганизмы, фитопатогены
• 
  Слайд 12
  

  Ti-плазмидыtumor-inducing, опухолеобразующиепоражают наземную часть растений найдены в Agrobacteriumtumefaciens– вызывающие образование у растений корончатых галлов, поражают, в основном, двудольные растения

• 
  Слайд 13
  

  Ri-плазмидыroot-inducing, вызывают образование «бородатого» корня,поражают ризосферу

  найдены в Agrobacteriumrhizogenesспособны перемещаться в клетки корней высших растений, встраиваться в их ядерную ДНК и индуцировать избыточное разрастание корней

• 
  Слайд 14
  

  Механизм действия агробактерий

  1. При повреждении клетки растения в почву попадают продукты обмена веществ – ацетосирингон и гидроацетосирингон
  2. Под их действием в плазмидах агробактерий активируются гены vir (вирулентности), обеспечивающие вырезание Т-ДНК (от англ. transferred, переносимый) из Ti-плазмиды
  3. В оболочке бактерии образуется разрыв, через который Т-ДНК переносится в растительную клетку
  4. Фланкирующие последовательности встраивают Т-ДНК в геном растительной клетки
• 
  Слайд 15
  

  Механизм действия агробактерий

  • В геноме растения Т-ДНК запускает синтез ферментов, необходимых для синтеза растительных гормонов: ауксина и цитокининов
  • Гормоны действуют на клетки растения и вызывают местное разрастание тканей
  • Включаются гены nos (нопалинсинтетазы), ферменты которых обеспечивают синтез в зараженных клетках опинов, которые Агробактерии используют как источник углеводов и азота
• 
  Слайд 16
  

  Ti-плазмиды. Структура.

  Размер от 200 т.п.н. до 800 т.п.н

  Основные элементы:

  • Оri-область
  • Vir-область
  • Область Т-ДНК
  • Ауксины (индол-3-уксусная к-та)

  - формирование корней, побегов, индукция соматического эмбриогенеза и пр.

  • Цитокинины (кинетин) – » – ингибируют образование корней
  • Опины (нопалин) - производные аргинина
• 
  Слайд 17
  

  Ti-плазмиды. Механизм действия

• 
  Слайд 18
  

  Ti-плазмиды. Вырезание Т-ДНК.

• 
  Слайд 19
  

  Перенос Т-ДНК в растительный геном

  Т-ДНК встраиваются в разные, по-видимому случайные, точки хромосом, но никогда не интегрируют с ДНК митохондрий и хлоропластов

• 
  Слайд 20
  

  Модификация Ti-плазмид для трансгенеза. НеонкогеннаяTi-плазмида

  • удаляется область Т-ДНК
  • добавляется сайт инициации репликации (ori) плазмиды Escherichiacoli
  • добавляются маркерные гены
• 
  Слайд 21
  

  Векторы для генетической трансформации растительных геномов. Бинарные векторы.

  БИНАРНЫЕ

  Содержат 2 сайта оri (для Е. соliи для A. tumefaciens),

  Т-ДНК, трансген

  Механизм действия:

  1.вектор клонируют в Е. Соli

  2.вектор переносят вA.tumefaciens, несущую неонкогеннуюTi-плазмиду

  3. трансгенез

  • Бинарный вектор
  • Трансген
  • Репортер растений
  • Ori E.coli
  • Ori A.tumef.
  • Репортер бактерий

• 
  Слайд 22
  

  Векторы для генетической трансформации растительных геномов. Коинтегративные

  КОИНТЕГРАТИВНЫЕ

  Содержат oriЕ. coli, Т-ДНК, фрагмент гомологичный Т-ДНК неонкогеннойTi-плазмиды

  Механизм действия:

  1. вектор клонируют в E.coli

  2. в Т-ДНК встраивают трансген и клонируют в E.coli

  3. вектор переносят в A.tumefaciensс неонкогеннойTi-плазмидой

  4.образуется рекомбинантная плазмида

  5. трансгенез

• 
  Слайд 23
  

  Векторы для генетической трансформации растительных геномов. Коинтегративные

• 
  Слайд 24
  

  Использование агробактерий в трансгенезе растений недостаток системы агробактерий – это неспособ­ность трансформировать злаковые

• 
  Слайд 25

  опосредованный ДНК перенос генов. DMGT- векторы

  ЭТАП 1.

• 
  Слайд 26
  

  DMGT-векторы (DNA-mediated gene transfer)

• 
  Слайд 27
  

  DMGT-векторы (DNA-mediated gene transfer)

• 
  Слайд 28
  

  Вектор pBin 19 (11777 п.н.)

  • M13 R primer: AGG AAA CAG CTA TGA CCA T
  • M13F primer: TGT AAA ACG ACG GCC AGT
  • LB и RB – левая и правая границы
  • ColE1 ori– плазмида с в геном колицина E1
  • OriV– участок инициации репликации E.coli
• 
  Слайд 29
  

  ЭТАП 2. ВЫБОР И ПОДГОТОВКА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК-РЕЦИПИЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСГЕНЕЗА

  ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

• 
  Слайд 30
  

  Словарь

  • Тотипотентность – свойство клеток реализовать генетическую информацию ядра, обеспечивающую их дифференцировку, а также развитие до целого организма
  • Каллус – травматическая меристема, состоит из дедифференцированных, делящихся клеток
  • Суспензионнаякультура – культура соматических клеток, растущих в жидкой среде (глубинное культивирование)
  • Протопласт – содержимое растительной клетки, лишенное клеточной стенки
  • Меристемы – образовательные ткани, состоят из интенсивно делящихся клеток
• 
  Слайд 31
  

  При трансформации растений трансген может быть внесен:

  • в целые растений
  • в клетки каллусной либо суспензионной культуры
  • в интактные растительные клетки способные к вторичной регенерации
  • в хлоропласты
  • в протопласты
  • в зародыши
• 
  Слайд 32

  ЭТАП 3. ВСТРАИВАНИЕ ТРАНСГЕНА В ГЕНОМ РАСТЕНИЯ (В КЛЕТКУ-РЕЦИПИЕНТ)

  ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

• 
  Слайд 33
  

  Способы внесения трансгена в клетки растений

  • Прямые методы
  • Опосредованные методы
  • Электропорация
  • Микроинъекция
  • Биобалистика
  • Со-культивировние
  • Инокуляция
  • При помощи векторов:
  • Ti-плазмиды
  • Ri-плазмиды
  • Вирусы
• 
  Слайд 34
  
• 
  Слайд 35
  

  • ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ - клеточные мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под действием импульсов высокого напряжения, за счет формирования временных пор, через которые способны проходить экзогенные молекулы
  • МИКРОИНЪЕЦИЯ - генетическую конструкцию инъецируют в клетку
  • БИОБАЛЛИСТИКА - на е частички вольфрама, платины или золота, диаметром от 0,1 до 3,5 мкм, напыляется векторная ДНК, содержащая трансген.

  «Заряды» из пушки, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток.

• 
  Слайд 36
  

  БИОБАЛИСТИКА Общий вид и схема установки для биобаллистической доставки генов в клетки

  растений. Particle Inflow Gun,(John Finer, Philip Vain et al. 1992)

• 
  Слайд 37
  

  • via Agrobacterium
  • Перенос трансгенов в растения
  • Целое растение
  • Инфильтрация
  • Культивируемые in vitro клетки, компетентные к регенерации
  • Инфильтрация микроинъекция со-культивирование
  • Прямой перенос генов
  • Меристемы стеблевых апексов
  • Биобаллистика микроинъекция со-культивирование
  • З а р о д ы ш и
  • Биобаллистика
  • микроинъекция
  • со-культивирование

  П р о т о п л а с т ы при помощи ПЭГ

  • электропорация
  • микроинъекция
  • при помощи липосом

  Культивируемые in vitro клетки, компетентные к регенерации

  Биобаллистика электропорация при помощи лазера

• 
  Слайд 38
  
• 
  Слайд 39

  ЭТАП 4. ОТБОР ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК, РАСТЕНИЙ

  ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

• 
  Слайд 40
  

  Ti-плазмиды. Механизм действия

• 
  Слайд 41
  

  Alternative selection systembased on the phosphomannoseisomerase gene

  41

  • pNOV35SGFP
  • LB CMPS PMI pAnos P35S GFP pA35S RB
  • Rooting of transgenic plum on media with 10g/l mannose (right control)
  • GFP expression in transgenic
  • plum shoots
• 
  Слайд 42
  

  Протокол трансформации пшеницы: сочетание селекции на фосфинотрицине (РРТ) с визуальной селекцией по экспрессии гена gfp

  • 3.5мес
  • молодые колосья
  • незрелые эмбрионы (1-2 мм)
  • индукция эмбриогенеза 7-12дн.
  • трансформация
  • бомбардировкой
  • частицами
  • двойная селекция
  • трансгенных проростков
  • 2 мес (PPT+GFP)
  • двойная селекция
  • трансгенного каллуса
  • 1 мес (PPT+GFP)
  • укоренение
  • образование семян
  • линия Т0

  • 1 мес
  • 3 мес

  (PPT+GFP)

• 
  Слайд 43
  
• 
  Слайд 44
  
• 
  Слайд 45

  Внедрение в практику

  ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

• 
  Слайд 46
  
• 
  Слайд 47
  

  Предмет биотехнологии растений

  Генетическая трансформация растений – позволяет создавать растения:

  а) устойчивые к биотическим и абиотическим стрессам

  б) с улучшенными технологическими и питательными свойствами

  в) производящие вакцины, полимеры (пластик и каучук), топливо и смазочные материалы

• 
  Слайд 48
  

  48

  контрольтрансгенное

  Устойчивость трансгенного табака с геном bt к личинкам непарного шелкопряда

• 
  Слайд 49
  

  49

  контроль клон 2 клон 1

• 
  Слайд 50