Презентация на тему "Электрофоретическая подвижность ДНК в гелях"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Электрофоретическая подвижность ДНК в гелях

  Выполнила: Санаева Юлия, магистрант 1 года МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени первого Президента России Б. Н. Ельцина ИНСТИТУТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК Департамент «БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ» Кафедра физиологии и биохимии растений Екатеринбург 2014

• 
  Слайд 2

  Электрофорез в гелях

  метод, который служит для разделения макромолекул на основе их размера, электрического заряда и других физических свойств. «электро» + «форез» (греч. Phoros - «переносить») метод, в котором молекулы вынуждены перемещаться через пространство геля под воздействием электрического тока 2

• 
  Слайд 3

  Основные принципы метода

  В составе нуклеиновых кислот и белков присутствуют химические группы, обладающие в водном растворе электрическим зарядом. Величина общего заряда молекулы определятся количеством заряженных групп, их природой, а также pHраствора. в нуклеиновых кислотах в широком диапазоне pH на каждую фосфатную группу приходится заряд -1. Под действием внешнего электрического поля заряженные молекулы могут перемещаться к катоду или аноду, в зависимости от их суммарного заряда. 3

• 
  Слайд 4

  Электрофоретическая подвижность

  скорость движения молекулы в поле единичной напряжённости Именно различия в электрофоретической подвижности различных биологических молекул часто используются для разделения их смесей. где U – электрофоретическая подвижность ; d – расстояние (см), пройденное образцом в геле; E – напряжённость электрического поля (В/см) в межэлектродном пространстве; t – время миграции (сек). 4 d/t E

• 
  Слайд 5

  Типы гелей, используемых для электрофореза ДНК

  Агарозный гель Полиакриламидный гель Смешанные гели 5

• 
  Слайд 6

  Агарозныйгель

  Агароза – линейный полисахарид (~12 000 Да), Образование геля идёт путём связывания в пространственную сетку пучков нитей, за счёт образования водородных связей между ними. Агарозные гели имеют «поры» большого размера и используются для разделения больших молекул (>200 кДа). Разделение происходит быстро, но с ограниченным разрешением, т.к. полосы имеют тенденцию размываться (результат большого размера пор). Агарозные гели менее, чем полиакриламидные среды, чувствительны к случайным флуктуациям в макроструктуре молекул ДНК. 6 Агаробиоза (галактоза + 3,6–ангидрогалактоза)

• 
  Слайд 7

  Полиакриламидный гель

  удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся даже на один нуклеотид (секвенирование) 7 Акриламид

• 
  Слайд 8

  Смешанные гели

  При разделении крупных нуклеопротеиновых комплексов или частиц используют смешанные гели, состоящие из агарозы(ок. 0.5%) и полиакриламида (1.5% - 2.5%) Агарозавыполняет лишь функцию механического каркаса, который не нарушает эффект молекулярного сита, создаваемого сеткой ПААГ. Для образования такой структуры надо обеспечить условия, при которых агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ.   8

• 
  Слайд 9

  Факторы, определяющие скорость миграции ДНК через агарозный гель

  Размер молекул ДНК Концентрация агарозы КонформацияДНК Напряженность электрического поля Состав оснований и температура Концентрация ДНК в пробе Характер растворителя 9

• 
  Слайд 10

  Размер молекул ДНК

  Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются в геле со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс, а следовательно, и размеру. НО: молекулы ДНК должны достаточно свободно мигрировать в геле, лишь изредка сталкиваясь с его волокнами. 10

• 
  Слайд 11

  Концентрация агарозы

  соотношение Фергюсона устанавливает линейную зависимость между логарифмом электрофоретической подвижности (U) и концентрацией геля (Т): logU=logU0 –KRT, где U0 – электрофоретическая подвижность частицы в отсутствие геля; KR – коэффициент ретардации, зависящий от свойств геля, а также размеров и формы молекулы. В горизонтальных гелях агароза обычно используется в концентрации от 0.7% до 3% 11

• 
  Слайд 12
  

  Рекомендуемая концентрация агарозного геля для разделения линейных молекул ДНК

  12

• 
  Слайд 13

  Чем больше концентрация агарозы, тем меньше размер пор в геле

  13 Изменение эффективного радиуса пор в зависимости от концентрации агарового геля. ○ радиусы, рассчитанные на основании опытов с гемоглобином, а = 3.08 нм; ● радиусы, рассчитанные на основании опытов с вирусом южной мозаики фасоли, а = 14.0 нм.  

• 
  Слайд 14
  

  НО: чрезмерное увеличение концентрации агарозы может привести к ухудшению разделения, или даже к тому, что крупные молекулы ДНК совсем не смогут войти в поры геля. 14 Разделение одной пробы в агарозном геле различной концентрации (0.7 %, 1.0 % и 1.5%). С ростом концентрации геля разделение более длинных фрагментов ДНК ухудшается

• 
  Слайд 15

  Конформация ДНК

  M=const разные конформации: кольцевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) линейная (форма III), Разная электрофоретическая подвижность линейная форма (форма III) мигрирует медленнее всех 15

• 
  Слайд 16

  Напряженность электрического поля

  При низких напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. НО: увеличение напряженности поля приводит к тому, что более длинные молекулы начинают догонять более короткие ухудшение разделения . Opt: 5 В/см. При 10 в/см : полная остановка больших молекул ДНК. 16

• 
  Слайд 17
  

  Различные стадии миграции молекулы ДНК в агарозном геле. Напряжённость электрического поля 5 в/см

  17

• 
  Слайд 18
  

  Остановка молекулы ДНК в агарозном геле при напряжённость электрического поля 10 в/см

  18

• 
  Слайд 19

  Состав оснований и температура

  Слабая зависимость В агарозных гелях при 4 – 30оС изменения относительной электрофоретической подвижности ДНК не наблюдается. Обычно электрофорез в агарозных гелях ведут при комнатной температуре. НО:гели, содержащие менее 0,5% агарозы, очень мягкие, поэтому с ними работают при 4оС (они становятся более плотными). 19

• 
  Слайд 20

  Концентрация ДНК в пробе

  Недостаточная концентрация не визуализируем ДНК. Избыточное количество ДНК  бόльшая электрофоретическая подвижность искажается (размывается) форма полосы, а после окрашивания интенсивность её свечения перестаёт напрямую соответствовать количеству окрашенной ДНК. 2-500 нг в полосе шириной 0.5 см 20

• 
  Слайд 21

  Характер растворителя

  облако противоионов частично экранирует заряд самόй молекулы и ослабляет действие на неё электрического поля. само облако противоионов, обладая противоположным по отношению к молекуле зарядом, будет взаимодействовать с электрическим полем и смещаться в противоположную сторону, тормозя движение молекулы (явление электрофоретического трения). при движении молекулы отдельные ионы вокруг неё тоже непрерывно перемещаются в ионной атмосфере происходит непрерывное замещение ионов. Для вновь входящих ионов требуется время, чтобы найти своё место в поле макромолекулы и прийти в равновесие с её окружением, что приводит к нарушению сферически симметричной формы ионной атмосферы. В результате, двойной электрический слой позади частицы растягивается и тормозит её движение (явлениерелаксационного эффекта) 21

• 
  Слайд 22

  Сдвиг полос

  в процессе электрофореза фрагменты ДНК в одной дорожке геля движутся быстрее или медленнее, чем идентичные фрагменты в соседней дорожке. Причины:   — неодинаковое количество ДНК в разных дорожках;  — неодинаковые ионные условия в препаратах, внесенных в разные дорожки (присутствие примесей, влияющих электрофоретическую подвижность ДНК — солей, спирта, фенола, этидиумбромида и др.);  — избыточная напряженность электрического поля;  — перегрев и нарушение структуры геля (избыточный ток);  — истощение электрофорезного буфера;  — микрогетерогенностьгеля. —локальные искривления молекул ДНК(А 3-6 п.н., повторяющиеся каждые 10-11 пар; ПААГ) В некоторых случаях сдвиг полос носит не ступенчатый, а сглаженный характер (эффект "улыбки"). искажения электрофоретической картины поддаются математическому анализу (маркер в каждую 3-4 дорожку). 22

• 
  Слайд 23

  Измерение электрофоретической подвижности фрагментов ДНК

  «На глазок» – нельзя! Методы: измерение обычной линейкой (малая точность, неприменим для коротких гелей) Дигитайзер (графический планшет) (анг. — digitizer), представляющий собой электронный модуль, включающий курсор-измеритель и цифровое координатное устройство. компьютеризованные регистрирующие системы, снабженные соответствующими программными средствами. 23

• 
  Слайд 24

  Спасибо за внимание!

  24