Презентация на тему "Молекулярно-генетические методы"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Молекулярно-генетические методы

  Ассистент кафедры лабораторной диагностики ИПО БГМУ к.м.н. Билалов Ф.С.

• 
  Слайд 2
  

  Геном – полный набор генов, содержащий весь объем информации, необходимой для развития организма, его существования в определенных условиях среды и передачи всех наследственных свойств в ряду поколений. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ: ГЕНОМ Молекулярная медицина Своевременное выявление предрасположенности к возникновению патологии

• 
  Слайд 3
  

  Организация генома: составиструктура ДНК

• 
  Слайд 4
  

  Организация генома: ДНК – хроматин - хромосома

• 
  Слайд 5

  Нормальный кариотип человека

  46, ХХ (жен.) или 46, ХУ (муж.) 22 пары аутосом 2 половые хромосомы Гаплоидный набор (n) Диплоидный набор (2n)

• 
  Слайд 6
  

  ГЕНОМИКАинструмент молекулярной медицины наука, изучающая и «читающая» молекулярную структуру геномов живых организмов

• 
  Слайд 7
  

  Проект «Геном человека» 1990-2003 г («двойная спираль» открыта в 1953 г.!) Идентификация 3 миллиардов нуклеотидов!!! Прочтены гены многих наследственных моногенных заболеваний Обнаружены естественныевариации генома – однонуклеотидные замены – полиморфизмы единичных нуклеотидов – SNP Создание карты SNP - до 600 000 вариаций Основа геномики – расшифровка генома человека

• 
  Слайд 8
  

  МУТАЦИЯ? Естественные Вариации Генома??? Моногенные болезни чаще всего вызваны мутацией одного гена – однонуклеотидными заменами. Для этих болезней характерно менделевское наследование - аутосомно-доминантное, аутосомно-рецессивное и Х-сцепленное. Муковисцидоз, Фенилкетонурия, Спинальные амиотрофии, Нейросиндромальная тугоухость

• 
  Слайд 9
  

  Мутация–это изменение в последовательности нуклеотидов ДНК, встречающиеся в популяции с частотой менее 1% и приводящие к состоянию несовместимому с жизнью, либо ведущему к неэффективному функционированию генома (моногенные болезни). Полиморфизм– это «мутации», встречающиеся в популяции с частотой 2% и выше и проявляющиеся в фенотипе не столь очевидно,и не приводящие к заметным нарушениям функции гена. Мутации и естественные вариации генома - полиморфизмы

• 
  Слайд 10
  

  МУТАЦИЯ Естественные Вариации Генома ПОЛИМОРФИЗМ

• 
  Слайд 11

  Гены кодируют последовательность аминокислот в белках

• 
  Слайд 12
  

  SNP – молекулярные свойства белка

• 
  Слайд 13
  

  SNP – приводят к появлению белковых продуктов с незначительно измененными физико-химическими свойствами SNP – молекулярные свойства белка

• 
  Слайд 14
  

  Конформация - 3D - формы молекул, которые могут динамически изменяться в пространстве. Аффинность -термодинамическая характеристика, количественно описывающая силу взаимодействия антигена и антитела или лиганда и рецептора. Связь с субстратом - величина, характеризующая прочность связи между ферментом и субстратом (насыщение химической реакции, обусловленная соотношением между концентрацией субстрата и скоростью реакции) Температурный оптимум активности фермента Время «жизни» молекулы Посттрансляционная модификация –достройка белковой молекулы углеводными, липидными и пр. молекулярными компонентами. Избыточный синтез белка – нарушение регуляции SNP – молекулярные свойства белка

• 
  Слайд 15
  

  Нормальный белок МУТАЦИЯ!!!-моногенное заболевание!!! Полиморфизм Как это представить?

• 
  Слайд 16
  

  Норма МУТАЦИЯ!!!-моногенное заболевание!!! Полиморфизм Как это представить (по другому)?

• 
  Слайд 17
  

  Как это увидеть?

• 
  Слайд 18
  

  Сетчатка Мышцы Мозг Сердце Цвет глаз Группы крови Изоферменты лактатдегидрогеназы

• 
  Слайд 19
  

  Моногенные болезни Наследственность Окружающая среда Геномика и болезни цивилизации Сахарный диабет , подагра , гипертоническая болезнь , ИБС, тромбофилии, язвенная болезнь, астма и онкопатология , нейродегенеративные заболевания, проблемы репродуктивного здоровья.

• 
  Слайд 20
  

  Индивидуальный подходк человеку на основе его генетической уникальностипозволяет предсказывать: ГЕНОМИКА развитие патологиии и проводить устранение опасных факторов окружающей среды до возникновения болезни особенности строения и жизнедеятельности организма

• 
  Слайд 21
  

  Болезнь – любое патофизиологическое состояние, увеличивающее вероятность смерти.

• 
  Слайд 22
  

  Cтепень взаимосвязи между наличием генетического фактора и риском развития заболевания. Величина OR указывает, во сколько раз риск данного заболевания выше у носителей данного генетического фактора, чем у лиц, не имеющих данного генетического фактора. Относительный риск (OR) и ГЕНОМИКА

• 
  Слайд 23

  Критерии выбора клинически значимых полиморфизмов

  Белок, кодируемый геном участвует в патогенетическом пути развития заболевания Полиморфный аллель изменяет структуру и/или функциональную активность белка Достоверные ассоциации заболевания с данным генетическим вариантом показаны несколькими независимыми группами исследователей (+ метаанализ)

• 
  Слайд 24
  

  У каждого двойной «комплект» генов

• 
  Слайд 25
  

  CCGAAATTTTTCGTCCAGCATACGTACCA CCGAAATTTTTCGTACAGCATACGTACCA CCGAAATTTTTCGTTCAGCATACGTACCA CCGAAATTTTTCGTGCAGCATACGTACCA АЛЛЕЛЬ (от греч. allelon - друг друга, взаимно) - различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых локусах (участках) гомологичных (парных) хромосом, контролирующие один и тот же белок. Все гены любых клеток, за исключением генов, расположенных в половых хромосомах, представлено двумя аллелями, один из которых унаследован от отца, а другой - от матери.

• 
  Слайд 26
  

  Полиморфизм генов и предрасположенность к мультифакторным заболеваниям: принципы

  Распространенность SNP зависит от географии и этнической принадлежности. SNP – либо предрасполагают, либо препятствуют проявлению и развитию заболевания. Гены аллельные варианты которых содержат SNP и при наличии определенных условий (диета, экология, вредные привычки, образ жизни, лекарства) предрасполагают к определенным мультифакторным заболеваниям – гены предрасположенности. Сочетание аллельных вариантов генов с SNP, вовлеченных в развитие конкретной патологии – «генные сети». У гомозигот риск развития заболевания выше, чем у гетерозигот.

• 
  Слайд 27

  Профили обследования SNP

  Системы свёртывания крови и фибринолиза

• 
  Слайд 28
  

  Сердечно-сосудистые заболевания - гипертензия

• 
  Слайд 29
  

  Сердечно-сосудистые заболевания – нарушения липидного обмена

• 
  Слайд 30
  

  Индивидуальное лекарство – подбор дозы варфарина (антикоагулянтов ряда кумарина)

• 
  Слайд 31
  

  Полимеразная цепная реакция(ПЦР) -метод молекулярной диагностики, применяемый в клинической практике для обнаружения специфической НК возбудителя в исследуемом материале.

• 
  Слайд 32

  Полимеразная цепная реакция

  ПЦР сопряженная с обратной транскрипцией Гнездовая ПЦР ПЦР in situ Количественная ПЦР Мультипраймерная ПЦР Ассиметричная ПЦР ПЦР с «горячим стартом» Амплификация больших фрагментов ДНК с высокой точностью Аллель-специфическая ПЦР ПЦР, чувствительная к метилированию матрицы Иммуно-ПЦР

• 
  Слайд 33

  Принцип метода

  Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка НК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro).

• 
  Слайд 34

  Методика ПЦР

  Выделение ДНК Амплификация ДНК Детекция ДНК

• 
  Слайд 35
  

  -Преаналитический этап сбор, хранение, транспортировка - Выделение НК экспресс-методы, универсальные методы - Сборка амплификационной смеси - Амплификация денатурация, отжиг, элонгация Детекция электрофорез, конечная точка, real-time

• 
  Слайд 36

  Преаналитический этап в пцр

  Цели Правильное определение информативного для ПЦР вида биологического материала. Сохранение ДНК возбудителя в материале до момента доставки в лабораторию. Препятствие попаданию в материал ингибиторов ПЦР-реакции. Предварительная очистка материала для облегчения выделения из него ДНК возбудителя.

• 
  Слайд 37

  Материал

  соскоб эпителиальных клеток моча секрет простаты эякулят цельная венозная кровь мокрота спино-мозговая жидкость, выпоты, слюна и проч. Все, что содержит ДНК!

• 
  Слайд 38
  
• 
  Слайд 39

  Ингибиторы пцр

  Гепарин Соли тяжелых металлов Слизь Кровь (гемоглобин) Некоторые лекарственные формы Мочевая кислота и ее соединения

• 
  Слайд 40

  Выделение днк

  Экспресс- методы (термический)

• 
  Слайд 41

  Сорбентный метод

  Классический сорбентный метод Преимущества: - чистота выделенной НК - универсальность использования Недостатки: - длительность - трудоемкость

• 
  Слайд 42
  
• 
  Слайд 43

  Амплификация

• 
  Слайд 44

  Детекция методом электрофореза

• 
  Слайд 45

  Детекция по конечной точке

• 
  Слайд 46

  Результаты ПЦР на образцах с одинаковым количеством ДНК

• 
  Слайд 47

  Интерпретация результатов

  Отрицательный ответ НК возбудителя не обнаружено Концентрация НК ниже 1000 ДНК-копий/мл Неправильно выбран материал для исследования Положительный ответ - Присутствие НК возбудителя - Присутствие фрагментов НК возбудителя

• 
  Слайд 48

  Преимущества ПЦР-метода

  Прямое определение наличия возбудителей. Высокая специфичность. Высокая чувствительность. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Высокая скорость получения результата анализа

• 
  Слайд 49
  

  Спасибо за внимание!