Презентация на тему "Молекулярное клонирование: основные вектора и штаммы"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Молекулярное клонирование: основные вектора и штаммы

  Это раздел молекулярной биологии, имеющий отношение к получению клонов (чаще всего E.coli), несущих рекомбинантную ДНК с целью, например, ее амплификации, наработки. Ген (фрагмент ДНК, … ) + Вектор (плазмида, ВАС, космида…) = Рекомбинантная ДНК (хозяин - E.coli, чаще всего)

• 
  Слайд 2
  

  Историческая справка Основные открытия: Работы Кемпбелла с бактериофагом лямбда. Эксцизия с кусками хозяйской ДНК – «клонирование» (60-е годы) 60-е и 70-е гг – открытие и изучения явления Рестрикции-Модификации. (Лурия, Арбер, Янг) открытие эндонуклеаз рестрикции Классификация. Три типа Тип II – наше все. Номенклатура. EcoRI: E(scherichia) co(li) R – 1 Открытие полимеразной цепной реакции

• 
  Слайд 3
  

  Клонирование шаг за шагом: Выбор штамма-хозяина Выбор и приготовление вектора Приготовление ДНК для клонирования Создание рекомбинантной ДНК Введение рекомбинантной ДНК в штамм-хозяин Селекция клонов (организмов), содержащих рекомбинантную ДНК Скрининг клонов на наличие нужной ДНК

• 
  Слайд 4
  

  Используемые ферменты нуклеинового обмена в молекулярном клонировании Термофильная ДНК-полимераза Полимеразная цепная реакция Обратная транскриптаза ДНК-лигаза – второй ключевой фермент в молекулярном клонировании. Особенность ДНК-лигазы фага Т4 Реже используемые: фосфатаза, киназа, ДНК-полимераза…

• 
  Слайд 5
  

  Вектора и их использование в молекулярном клонировании

• 
  Слайд 6
  

  Плазмиды: Селекция (антибиотики) Фенотипическая селекция (альфа-комплементация, белые-синие) Отбор клонов: выделение и рестрикция, ПЦР-скрининг, гибридизация. Пример, плазмидаpUC19

• 
  Слайд 7
  

  В качестве примера. Клонирование в плазмидe pUC19. Выбор штамма-хозяина. E.coliс генотипом lacZ′ ΔM15–дефектная бета-галактозидаза. фенотипическая селекция (альфа-комплементация) Выбор и приготовление вектора Полилинкер – набор возможных рестриктаз. Гидролиз с последующей очисткой. Приготовление ДНК для клонирования ДНК, с липкими концами как у вектора Создание рекомбинантной ДНК «сшивка» вектора и ДНК для клонирования Введение рекомбинантной ДНК в штамм-хозяин приготовление компетентных клеток E.coli соответствующего штамма трансформация лигазной смесью компетентные клетки Селекция клонов (организмов), содержащих рекомбинантную ДНК антибиотик – ампициллин, фенотипическая селекция «белые-синие» Скрининг клонов на наличие нужной ДНК рестрикционный анализ, гибридизация с зондами, ПЦР-скрининг Плазмиды, в зависимости от целей клонирования могут нести множество специальных районов. Это, например, терминаторы, промоторы, последоваетльностиКозака, полилинкеры, вспомогательные гены и другие..

• 
  Слайд 8
  
• 
  Слайд 9
  

  Требования к E.coliштаммам-рецепиентам для молекулярного клонирования. Список мутаций можно посмотреть, например, в фирмах, продающих клетки: http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/competent_cells/genetic_markers.asp Важно знать какие мутации нужны в каких экспериментах. Можно составить список штаммов с их свойствами. Например:

• 
  Слайд 10
  

  Штаммы для клонирования:

• 
  Слайд 11
  

  Штаммы для экспрессии белков: