Презентация на тему "Теломеры. Теломеразная активность."

Содержание

• 
  Слайд 1

  Теломеры. Теломеразная активность.

• 
  Слайд 2

  Во первых, что такое «теломеры»?

  Теломеры – это - специализованные концевые районы линейной хромосомной ДНК, - состоят из многократно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей. - В состав теломер входят также многие белки, специфически связывающиеся с теломерными ДНК-повторами.

• 
  Слайд 3
  

  - Таким образом, теломеры (так же, как и все другие районы хромосомы эукариот) построены из дезоксинуклеопротеидов (ДНП), то есть комплексов ДНК с белками. - Существование таких участков было доказано в 1938 году классиками генетики, лауреатами Нобелевской премии Барбарой Мак-Клинток и Германом Мёллером. Независимо друг от друга они обнаружили, что фрагментация хромосом (под действием рентгеновского облучения) и появление у них дополнительных концов ведут к хромосомным перестройкам и деградации хромосом. В сохранности оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам. Лишенные концевых теломер, хромосомы начинают сливаться с большой частотой, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям. - они заключили, что естественные концы линейных хромосом защищены специальными структурами. Г. Мёллер предложил называть их теломерами (от греч. телос - конец и мерос - часть). - но и, по-видимому, ответственны за прикрепление хромосом к специальной внутриядерной структуре (своеобразному скелету клеточного ядра), называемой ядерным матриксом - Таким образом, теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Более того, мы покажем, что наличие на концах хромосом специальной теломерной ДНК позволяет решить так называемую проблему концевой недорепликации ДНК.

• 
  Слайд 4
  
• 
  Слайд 5

  Структура теломер

  Теломерная ДНК имеет определенный состав, а для поддержания ее длины, как правило, используется специальный фермент — теломераза. Нуклеотидная структура теломерных последовательностей ДНК нам уже известна. Более высокие уровни организации образуются за счет специфических белков. Видимо, эти белки, в отличие от обычных гистонов, не образуют нуклеосомные глобулы. Нуклеосомная структура в доста¬точно коротких теломерах не обнаружена. Хотя длинные тело-меры мышей имеют нуклеосомную организацию. Самые известные среди теломерных белков — белок Rapl (у дрожжей) и его аналог белок TRF1 (у млекопитающих). Очевидно, благодаря этим белкам, теломеры имеют плотную упаковку, т. е. относятся к фракции гетерохроматина. В свою очередь, такая структура делает теломеры весьма стабильными. В частности, теломерные повторы недоступны для теломеразы на протяжении большей части клеточного ци¬кла. Очевидно, в S-фазе в ответ на некий сигнал белок TRF1 диссоциирует от теломеры — начинается ее удлинение. Затем же он вновь связывается и тем самым предупреждает избыточный рост теломеры.

• 
  Слайд 6
  

  По той же причине теломерные участки ДНК малодоступны для других ферментов — ДНК-метилаз и эндонуклеаз. В связи с последним обстоятельством, при мейозе в области теломер очень низка частота двухцепочечных разрывов. Наконец, с помощью теломерных белков теломеры крепятся к компонентам ядерного матрикса, в т. ч., возможно, к ядерной ламине (пластинке, связанной с внутренней ядерной мембраной). Действительно ли во всех клетках теломеры прикреплены к ядерной мембране, пока не вполне ясно. Но, по крайней мере, на ранних и средних стадиях профазы мейоза такая связь, бесспорно, существует. Полагают также, что теломерная ДНК образует несколько петель (в виде «лепестков ромашки»), фиксированных на матриксе; и по мере укорочения теломер число «лепестков» постепенно уменьшается.

• 
  Слайд 7

  Функция теломер

  Теперь обсудим известные функции теломер. 1. Некоторые функции можно условно обозначить как механические. а) Так, только что было сказано, что теломеры участвуют в фиксации хромосом к ядерному матриксу. Это важно для правильной ориентации хромосом в ядре, и данное обстоятельство особенно проявляется в мейозе.

• 
  Слайд 8
  

  На зиготенной стадии профазы мейоза происходят направленные перемещения концов хромосом на поверхности ядерной мембраны — так, что концы гомологичных хромосом смыкаются и с них начинается спаривание (конъюгация) этих хромосом строго однородными участками. б) Кроме того, теломеры сцепляют друг с другом концы сестринских хроматид (образующихся в хромосоме после S-фазы). Возможно, это сцепление происходит за счет гибридизации теломер сестринских ДНК. В то же время структура теломер такова, что допускает расхождение хроматид в анафазе. Однако возможна мутация (на уровне гена теломеразной РНК), которая меняет ну-клеотидную последовательность теломер; тогда расхождение хроматид блокируется.

• 
  Слайд 9
  

  2. Функции второй группы — стабилизационные. а) Важнейшая из них нам уже знакома: если в клетке нет теломеразы (или ALT), то наличие теломер предохраняет от недорепликации генетически значимые отделы ДНК. б) Если же в клетке есть теломеразная активность, то появляется еще одна возможность — стабилизация концов разорванных хромосом. Так, при случайном разрыве хромосомы образуются фрагменты, на одном или на обоих концах которых нет теломерных повторов. В отсутствие теломеразы эти фрагменты претерпевают слияния и деградацию, что блокирует клеточный цикл и ведет клетку к гибели. В присутствии же теломеразы к местам разрыва присоединяется теломерная ДНК. Это стабилизирует хромосомные фрагменты и позволяет им функционировать. В частности, данный феномен обнаружен у больных а-та-лассемией: в генах а-глобина происходят разрывы хромосомы 16q, и к поврежденному концу добавляются теломерные повторы.

• 
  Слайд 10
  

  3. Влияние на экспрессию генов. Еще одно интереснейшее свойство теломер обозначается как фф т положения: активность генов, расположенных рядом с теломерами, снижена (репрессирована). Такой эффект часто обозначается как транскрипционное молчание, или сайленсинг (процесс установления и поддержания репрессированного состояния). При значительном же укорочении теломер эффект положения пропадает и прителомерные гены активируются. а) Сайленсинг может быть результатом действия белков (таких, как Rapl или TFR1), взаимодействующих с теломерами. Тем более, как уже отмечалось, эти белки снижают доступность теломерной ДНК для целого ряда ферментов. б) С другой стороны, эффект положения может быть обусловлен близостью к ядерной оболочке. Так, по гипотезе А. М. Оловникова, в этой оболочке могут располагаться Са2'-каналы, и поток ионов Са" влияет на взаимодействие белков с близлежащими генами. Эффект положения может коснуться и внутренних генов, если какой-нибудь из таких генов становится транспозоном (геном, способным к перемещению в другой участок ДНК) и встраивается в теломерную область. Или если происходит разрыв хромосомы и образование на концах разрыва теломерных повторов: с помощью последних становится возможно связывание теломерных белков и прикрепление к ядерной мембране.

• 
  Слайд 11
  

  4. «Счетная» функция. Наконец, теломерные отделы ДНК выступают в качестве часового устройства (т. н. репликометра), которое отсчитывает количество делений клетки после исчезновения теломеразной активности. Действительно, как уже отмечалось, каждое деление приводит к укорочению теломеры на 50-65 н. п. Причем гораздо важней для клетки не то, сколько делений уже прошло, а сколько еще осталось до критического укорочения теломеры. Поэтому можно сказать и так, что теломеры — устройство, определяющее количество делений, которые способна совершить нормальная клетка в отсутствие теломеразы. Достигая же критически короткой длины, теломеры теряют возможность выполнять все или многие из вышеперечисленных функций. Нарушается клеточный цикл, и в конечном счете клетка погибает.

• 
  Слайд 12

  Как работает теломераза( или механизмы теломеразы)

  Теломераза – это фермент‚ синтезирующий тандемно повторяющиеся сегменты ДНК, из которых состоит G-цепь теломерной ДНК. - она относится к классу ДНК-полимераз - Ферменты этого класса, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, очень хорошо известны молекулярным биологам. Они закодированы и содержатся в ретровирусах (например, в вирусе иммунодефицита человека, вызывающем заболевание СПИДом) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, который в ретровирусе представлен РНК. - РНК, используемая теломеразой для синтеза теломерной ДНК в качестве матрицы, входит в состав этого фермента. В этом уникальность теломеразы: на сегодня это единственная известная РНК-содержащая обратная транскриптаза. - Теломеразные РНК у разных организмов сильно различаются по длине и структуре.

• 
  Слайд 13
  

  - Как и любая другая РНК клетки, теломеразная РНК обладает специфической вторичной и третичной структурой. Вторичная структура изолированной теломеразной РНК достоверно установлена только для теломераз простейших. Пространственная структура теломеразной РНК в составе ферментативного комплекса пока еще неизвестна. - Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК, которые он кодирует и которым он, разумеется, комплементарен. - Так как теломераза синтезирует сегменты ДНК, повторяющиеся много раз, используя только один сегмент своей РНК, она должна обладать способностью периодически (после завершения синтеза каждого повтора) перемещать (транслоцировать) матричный участок в район 3'-конца синтезируемой теломерной ДНК. Источником энергии для такого перемещения, по-видимому, служит сама реакция синтеза цепи теломерной ДНК, поскольку дезоксинуклеозидтрифосфаты - субстраты этой реакции - высокоэнергетические вещества.

• 
  Слайд 14
  

  Такое удлинение возможно, потому что концы хромосом содержат повторы из нескольких нуклеотидов (например, у человека ТТАGGG), которым комплементарен участок РНК - компонента теломеразы. Таким образом, теломераза узнает выступающий 3'-конец и удлиняет его. В таком случае удается, снова с использованием ДНК-затравки и РНК-матрицы, достроить конец ДНК. Широкое распространение теломераз среди эукариот говорит о том, что механизм синтеза теломерной ДНК, который мы наблюдаем у современных организмов, возник очень давно. Более того, эволюционно-генетический сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов каталитических субъединиц теломераз и других обратных транскриптаз показывает, что этот механизм мог существовать еще до появления первых эукариотических клеток.

• 
  Слайд 15

  О методах определения активности теломеразы.

  Как же определяют наличие теломеразы в том или ином биологическом объекте? Имеются два основных метода.

• 
  Слайд 16
  

  Вт. н. прямом методе в инкубационную смесь, кроме иссле дуемого образца, вносят праймер G-цепи (олигонуклеотид, содержащий несколько теломерных повторов) и меченые дНТФ. Праймер выступает в роли G-цепи, с которой связывается и которую затем удлиняет теломераза. О наличии активности судят по включению радиоактивности в состав олигонуклеотида. Второй, непрямой, метод — т. н. TRAP-анализ (TelomerRepeatAmplificationProtocol); он использует ПЦР — полимераз-ную цепную реакцию. Здесь в смесь, помимо образца, тоже добавляют G-праймер и меченые нуклеотиды. Но, кроме того, в смесь вносят С-праймер и термостойкую бактериальную ДНК-полимеразу. Благодаря этому, в ходе ПЦР происходит многократное «клонирование» (или амплификация) удлиненного теломеразойолигонуклеотида.

• 
  Слайд 17
  

  С удлиненной G-цепью взаимодействует С-праймер, после чего он наращивается ДНК-полимеразой (использующей G-цепь в качестве матрицы). Образуется двухцепочечная ДНК. Ее цепи разделяют нагреванием. С удлиненной С-цепью взаимодействует G-праймер, который затем наращивается ДНК-полимеразой. Образующуюся двухцепочечную цепь вновь разделяют нагреванием — в среде появляется дополнительная удлиненная G-цепь. Но теперь она синтезирована уже не теломеразой, а ДНК-полимеразой — путем двустадийного копирования первой G-цепи. И так далее. Многократно чередуются циклы, включающие взаимодействие С-илиG-праймера с соответвующей ДНК полимеразное копирование этой цепи и разделение двух цепей путем нагревания.

• 
  Слайд 18
  

  Все это происходит в одной пробирке, поскольку термостабильная ДНК-полимераза выдерживает нагревание в конце каждого из многочисленных циклов. В итоге количество G-цепей амплифицируется (умножается) примерно в 10 раз, и, соответственно, во столько же раз повышается чувствительность метода.Продукты реакции подвергают гель-электрофорезу и получают спектр радиоактивных полос, соответствующих удлиненным олигонуклеотидам. С появлением TRAP-анализа резко облегчилось выявление теломеразы в различных объектах. Однако и до сих пор речь, в основном, идет лишь о качественном выявлении активности. Стандартного же способа измерения уровня активности до последнего времени не существовало.

• 
  Слайд 19
  

  Кроме того, оценивая те или иные результаты, надо иметь в виду возможность артефактов. Одни обстоятельства методического характера могут маскировать теломеразную активность; другие, напротив, — давать ложноположительные результаты.

• 
  Слайд 20
  

  Таким образом, изучение тонкой структуры теломер и механизма действия теломераз находится еще только в начальной стадии. Однако они привлекают к себе огромный интерес исследователей, работающих в самых разных областях биологии и медицины, и здесь уже в ближайшее время можно ждать новых интересных открытий.