Презентация на тему "Трансгенез. Микроорганизмы"

Содержание

• 
  Слайд 1

  ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ

  Лекция 5

• 
  Слайд 2
  

  Перспективы развития генетической инженерии

• 
  Слайд 3

  РЕКОМБИНАЦИЯ

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

• 
  Слайд 4
  

  Рекомбинация– процесс реорганизации генома, обмен участками ДНК

  Словарь

• 
  Слайд 5

  Виды рекомбинационных событий

• 
  Слайд 6
  

  Классификация рекомбинационных явлений

• 
  Слайд 7
  

  Схема сайт-специфической рекомбинации бактериофага лямбда

  А) линейная (вирионная) ДНК фага

  Б) ДНК фага после инфекции в E. coli замыкается в кольцо, и находящийся в ней сайт attP вступает в рекомбинацию с сайтом attB в хромосоме бактерии

  В) продукт рекомбинации - профаг в составе хромосомы бактерии

  Г) запись процесса рекомбинации в общем виде

• 
  Слайд 8

  РЕКОМБИНОГЕНЕЗ

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

• 
  Слайд 9
  

  • позволяет кардинально изменять живые организмы на генетическом уровне, вплоть до создания новых видов с новыми заданными свойствами
  • СОВРЕМЕННЫЕ
  • РЕКОМБИНОГЕНЕЗ
  • Клеточная инженерия культивирование гибридизация реконструкция
  • Генетическая инженерия метод рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование

  Методы селекции

  • Белковая инженерия рациональный дизайн направленная эволюция
• 
  Слайд 10

  Открытие явления трансформации

  1928 г. открытие явления трансформации Фредерик Гриффит

  Streptococcuspneumoniae– пневмококки.

  • Бактерии, вызывающие пневмонию.
  • Капсульный S-штамм – патогенный
  • БескапсульныйR-штамм – непатогенный
• 
  Слайд 11
  

  • Метод создания новых генетических программ путем конструирования и внесения новой генетической информации в уже существующие живые организмы
  • Генетическая инженерия или молекулярное клонирование
• 
  Слайд 12
  

  Berg, Paul (США) (р. 1926) Нобелевская премия по химии, 1980

  История метода

  • 1972 г. – появление методологии
  • Пол Берг сконструировал rДНК из фрагмента ДНК вируса SV40, бактериофага λ и оперона E. Coli
• 
  Слайд 13
  

  1972 г. Анни Чанг

  Герберт Бойер Поль Берг Стенли Коэн установили, что при помощи ферментов рестриктазможно порезать две любые молекулы ДНК и сделать из них одну рекомбинантную ДНК

  • Поль Берг
  • Стенли Коэн
  • Герберт Бойер
  • Анни Чанг
• 
  Слайд 14

  ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ФЕРМЕНТОВ

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

• 
  Слайд 15
  

  «Генетическая инженерия – потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты»

  З.И.Абрамова

• 
  Слайд 16
  
• 
  Слайд 17
  
• 
  Слайд 18
  

  Суть метода

• 
  Слайд 19
  

  • РекомбинантнаяДНК– искусственно сконструированная ДНК, несущая фрагменты генетической информации разных организмов
  • Трансгенез– процесс перенос гена или группы генов из одного организма в другой и создание условий для его/их экспрессии
  • Векторы– системы доставки трансгена, обеспечивающие его интеграцию, амплификацию и экспрессию

  Словарь

• 
  Слайд 20
  

  I этап Получение гена

  II этап Создание рекомбинантной ДНК

  III этап Создание трансгенного организма

  IV этап Отбор модифицированных систем

  ТЕХНИКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

• 
  Слайд 21

  I ЭТАП. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНА

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

• 
  Слайд 22
  

  I этап Получение гена

  Цель: получение гена-матрицы для молекулярного клонирования

  Методы:

  1) рестриктазный

  2) химико-ферментативный синтез

  3) синтез на основе мРНК

• 
  Слайд 23
  

  Рестриктазы– ферменты, узнающие особые последовательности нуклеотидов в ДНК (сайты

  рестрикции)

• 
  Слайд 24
  

  Рестриктазы. Типы рестрикции.

• 
  Слайд 25
  
• 
  Слайд 26

  Химико-ферментативный синтез гена

  Разработан X. Кораной

  • хим. синтез комплементарных, взаимоперекрывающихсяолигонуклеотидов
  • соединение (лигирование) олигонуклеотидов с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы.
• 
  Слайд 27

  Синтез на основе mРНК

  ДНК

  • экзон
  • интрон
  • экзон
  • экзон
  • интрон
  • Транскрипция
  • РНКпервичный транскрипт
  • Сплайсинг
  • МатричнаяРНК
  • Обратная транскрипция
  • Клональная ДНК
• 
  Слайд 28
  
• 
  Слайд 29

  II ЭТАП. ПОЛУЧЕНИЕ рекомбинантной ДНК

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

• 
  Слайд 30
  

  I этап Получение гена

  II этап Создание рекомбинантной ДНК

  Цель: внесение гена-матрицы (трансгена) в вектор

• 
  Слайд 31

  ВЕКТОРА(лат. vector – несущий)

  молекулы способные к самостоятельной репликации и обеспечивающие интеграцию, амплификацию и экспрессию трансгена

• 
  Слайд 32

  Словарь

  • Амплификация– увеличение количества копий rДНК (трансген + вектор)
  • Интеграция– встраивание rДНК в ДНК хозяина
  • Экспрессия– транскрипция трансгена аппаратом клетки хозяина
• 
  Слайд 33
  

  Требования к векторным молекулам

• 
  Слайд 34
  

  • Классификация векторов по реципиентным системам
  • Естественные плазмиды бактериофаги
  • Искусственные космиды фазмиды бакмиды
  • Естественные плазмиды вирусы
  • Искусственныечелночныевекторы
  • Вектора прокариот
  • Вектора эукариот
• 
  Слайд 35

  Словарь

  • Бакмиды– челночные векторы на основе генома бакуловируса, способные существовать в клетках E.coli
  • Космиды– плазмидные векторы, в ко­торые встроен участок генома фага λ, обеспечи­вающий возможность упаковки молекулы в фаговую частицу
  • Фазмиды– векторы, которые содержат генетические элементы плазмид и бактериофагов
• 
  Слайд 36
  
• 
  Слайд 37
  

  Классификация векторов по функциям

  • Клонирующие вектора, обеспечивающие репликацию гибридной молекулы в клетке
  • Экспрессирующие вектора, обеспечивающие правильную и эффективную экспрессию чужеродной ДНК в клетке-реципиенте
  • Интегративные вектора, обеспечивающие интеграцию чужеродной ДНК в геном реципиента
• 
  Слайд 38
  

  • I этап Получение гена
  • II этап Создание рекомбинантной ДНК

  Методы введения гена в вектор: рестриктазно-лигазный коннекторный

• 
  Слайд 39
  

  • Применим для гена и вектора с комплементарными «липкими» концами
  • Рестриктазо-лигазный метод
• 
  Слайд 40
  

  • Впервые был применен С. Коэном в 1973 году.
  • Рестриктазы, вносят в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образуют "ступеньку"

  Рестриктазо-лигазный метод

• 
  Слайд 41
  
• 
  Слайд 42
  
• 
  Слайд 43
  

  Применим для гена и вектора с некомплементарными «тупыми» концами

  Коннекторный метод

  Впервые был выполнен в 1972 году П.Бергом.

  Экзонуклеаза отрезает «тупые» концы

  Терминальная трансфераза пришивает линкерные молекулы к 3'-концам фрагментов ДНК вектора достраивают одноцепочечные олиго (dA)-сегменты, а к 3'-концам фрагмента трансгена олиго (dT)-сегменты линкеры соединяются за счет комплементарности (dА)- и (dT)-последовательностей

• 
  Слайд 44
  
• 
  Слайд 45

  III ЭТАП. Создание трансгенного организма

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

• 
  Слайд 46
  

  • I этап Получение гена
  • II этап Создание рекомбинантной ДНК
  • III этап Создание трансгенного организма

  Цель: введение гена-матрицы в организм-реципиент

  Методы введения рДНК в клетку:

  • конъюгация
  • трансдукция
  • трансфекция
  • трансформация
• 
  Слайд 47
  

  • Естественные
  • Конъюгация
  • Трансдукция
  • Трансфекция
  • Искусственные
  • Трансформация

  Методы введения рДНКв клетку-реципиент

• 
  Слайд 48
  

  Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансдукция (вектор с элементами генома бактериоф

• 
  Слайд 49
  

  Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансфекция (вектор с элементами генома вируса)

• 
  Слайд 50
  

  Методы введения rДНК в клетку-реципиент коньюгация (вектор с элементами генома плазмид)

• 
  Слайд 51
  

  Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансформация (при физиологической некомпетентности)

  • микроиньекция
  • электропорация
  • липофекция
  • биобаллистика

• 
  Слайд 52

  IV ЭТАП. отбор

  ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

• 
  Слайд 53
  

  53

  I этап Получение гена

  II этап Создание рекомбинантной ДНК

  III этап Создание трансгенного организма

  IV этап Отбор модифицированных систем

  Цель:

  • оценка результата молекулярного клонирования

  Методы:

  • маркерный, иммунологическая детекция, скрининг, картирование, секвенирование
• 
  Слайд 54
  

  1. Отбор клеток, несущих вектор

  2. Отбор клеток, несущих ген-мишень

  Методы отбора

• 
  Слайд 55
  

  а) Применение репортерных (маркерных) генов первого, второго и третьего поколений:

  - NPT-ген (неомицинфосфотрансфераза и других антибиотикоустойчивых генов)

  - GUS-ген (глюкуронидаза)

  - GFP-ген (greenfluorescenceprotein)

  б) Селекция клеток на средах с антибиотиками

  в) Обнаружение продуктов экспрессии репортерных генов и/или их активности

  Отбор по векторам

  Селективные, репортерные маркеры

• 
  Слайд 56
  

  верхнем правом углу много мелких названий – это перечислены сайты рестрикции

  • Rep – это участок отвечающий за репликацию (размножение) плазмиды в клетке
  • Amp – репортерный ген устойчивости к антибиотику – ампициллину
• 
  Слайд 57
  

  • Отбор по векторам
  • Устойчивость к антибиотику
• 
  Слайд 58
  

  Отбор по векторам.

  GFP

• 
  Слайд 59
  

  Отбор по трансгену

  блот-анализа по Саузерену

  1. Синтезируют меченые нуклеотиды (ДНК зонды)

  2. Фрагмент целевой ДНК переводят на нитроцеллюлозный фильтр.

  3. Связавшиеся молекулы ДНК обрабатывают щелочным раствором, в результате одна нить ДНК «отрывается» от другой.

  4. На фильтр наносят раствор с ДНК-зондом, комплементарные участки совпадают, происходит гибридизация.

  5. Сканируют фильтр

• 
  Слайд 60
  

  Первые достижения

• 
  Слайд 61
  

  Гипофизарная карликовость