Презентация на тему "Репликация ДНКв клетке"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Репликация ДНКв клетке

  1) запаздывающая нить 2) лидирующая нить 3) ДНК полимераза (Polα) 4) ДНК лигаза 5) РНК праймер 6) ДНК праймаза 7) фрагмент Оказаки 8) ДНК полимераза (Polδ) 9) хеликаза 10) одиночная нить со связанными белками 11) топоизомераза ) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК); 2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК(затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК); 3) Синтез новой цепи ДНК

• 
  Слайд 2
  

  ПЦР: амплификация ДНК В отличие от амплификации ДНК в живых организмах(репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК

• 
  Слайд 3
  

  Отличия проведения ПЦР от процесса репликации, проходящего в клетке

• 
  Слайд 4
  

  ДНК-матрица, из которой необходимо амплифицировать лишь определенныйфрагмент. Достаточно несколько молекул – 2-50 ng Два праймера (18—30 оснований) - комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Нуклеотиды – строительный материал A, G, C, T -Термостабильная ДНК-полимераза(до 80 °C): фермент, участвующий в репликации ДНК. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин, краситель Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы Компоненты ПЦР

• 
  Слайд 5
  
• 
  Слайд 6
  

  Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты.

• 
  Слайд 7
  

  Количество копий ПЦР продукта на разных циклах амплификации

• 
  Слайд 8
  

  Seite 8 PCR basic Отжигпраймеров Основы ПЦР Неспецифичный отжиг праймеров (tотжигаслишком низкая) Специфичный отжиг праймеров Отсутствие отжига (t отжигаслишком высокая) кол-во ДНК?

• 
  Слайд 9
  

  ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

• 
  Слайд 10
  

  Праймеры Расходные материалы Пользователь АМПЛИФИКАТОР ДНК-матрица Реактивы Дозирование Фрагмент для амплификации Факторы, влияющие на ПЦР

• 
  Слайд 11
  

  Технология TaqMan® PCR – амплификация + детекция флуоресцентной метки (зонда)

• 
  Слайд 12
  

  PCR амплификация с двумя специфичными праймерами

• 
  Слайд 13
  

  Гибридизация зонда TaqMan с продуктом амплификации

• 
  Слайд 14
  
• 
  Слайд 15
  
• 
  Слайд 16
  
• 
  Слайд 17
  

  TaqMan

• 
  Слайд 18
  

  TaqMan

• 
  Слайд 19
  

  TaqMan

• 
  Слайд 20
  
• 
  Слайд 21

  ПринципинструментаПЦР в реальном времени

  Page 21 Источник возбуждения флюоресценции: Светодиод (СД, LED) Лазер Лампа фильтр Детектор PMT (фотоумножитель) работает в   режиме детекции фотонов: PMT CCD Фотодиод аплификатор - элементы Пельтье - воздух оптический блок особенность амплификатора: возбуждать и детектироватьфлюоресценцию, которая отражает накопление фрагмента на каждом цикле амплификации Основы ПЦР Основы ПЦРв реальном времени

• 
  Слайд 22
  

  Page 22 Флюоресцентные красители Основы ПЦРв реальном времени SYBR Green I излучение 521 nm возбуждение 494 nm специфичный краситель по отношению интеркаляции во все двухцепочечные ДНК (амплифицируемый ПЦР продукт, неспецифичные продукты: праймер-димеры). Это влияет на точность количественного анализа неспецифичный краситель по отношению к ПЦР продукту: увеличение флюорисценции может быть связано с накоплением как специфического продукта, так и неспецифического.

• 
  Слайд 23

  Детектирования продуктов ПЦР

  Page 23 Увеличение сигнала флюоресценции ...... ...... ...... ...... Основы ПЦРв реальном времени

• 
  Слайд 24
  

  В течение 30-40 циклов нарабатывается количествоДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза вагарозном геле или с помощью других несложных методик. (несколько мкг продукта) Кинетика ПЦР

• 
  Слайд 25
  

  Классическая ПЦР Основы ПЦР циклы флуоресценция циклы агарозный гель анализ ДНК - только после ПЦР (требуется еще провести электофорез) насыщение PCR реакции после 35-40 циклов