Презентация на тему "Молекулярно-генетические методы диагностики"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Молекулярно-генетические методы диагностики

• 
  Слайд 2

  Общие методы

  Выделение ДНК Полимеразная цепная реакция Рестрикционный анализ Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле Блотинг по Саузерну

• 
  Слайд 3

  Оборудование для ДНК-диагностики

  Амплификаторы Термостаты настольные для пробирок (от 25-95С) Центрифуга для микропробирок Трансилюминатор

• 
  Слайд 4

  Выделение ДНК

  Образец- любые ядросодержащие клетки Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК Выделение с использованием ион-обменных смол

• 
  Слайд 5

  Источники геномной ДНК

  Цельная кровь Культура клеток Букальный эпителий Пятна высушенной крови Другие источники Сыворотка, плазма крови, образцы мочи, образцы тканей При делециях мтДНК предпочтительный материал – образец мышечной ткани

• 
  Слайд 6

  Электрофорезная камера

  Фрагменты ДНК Буфер Агарозный гель Чем меньше фрагменты ДНК, тем быстрее они передвигаются в геле

• 
  Слайд 7

  Электрофорез

• 
  Слайд 8

  ПЦР

  Состав реакционной смеси: Образец Буфер, содержащий ионы магния Смесь дНТФ Taq-полимераза Специфические олигонуклеотидные праймеры

• 
  Слайд 9
  

  Стадии ПЦР Денатурация Отжиг Элонгация

• 
  Слайд 10

  ПЦРполимеразная цепная реакция

• 
  Слайд 11

  Специфичность ПЦР

• 
  Слайд 12

  ДНК-диагностика

  Подтверждение диагноза Диагностика носительства Пресимптоматическая диагностика Пренатальная (дородовая) диагностика Предимплантационная диагностика

• 
  Слайд 13

  Прямая ДНК-диагностика

  Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания Косвенная ДНК-диагностика Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе

• 
  Слайд 14

  ДНК-ДИАГНОСТИКА

  ПРЯМАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА Возможна только когда известна структура гена Возможна и без больного члена семьи ( анализ ДНК родителей пробанда) Высокая точность Возможна при полилокусном заболевании КОСВЕННАЯ ДНК-ДИАГНОСТИ КА Возможна когда известно положение гена, а мутация или последовательность неизвестны обязательно проведение семейного анализа и анализ образца больного члена семьи Точность зависит от расположения маркеров Обязательно наличие одного локуса заболевания

• 
  Слайд 15

  Прямая ДНК-диагностика

  ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллель-специфическая амплификация, ПДАФ) ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) Секвенирование (определение последовательности) гена Блотинг по Саузерну Биочипы

• 
  Слайд 16

  ПДАФ

  Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов Примеры : регистрация небольших делеций и дупликаций ДНК-диагностика частой мутации ΔF508 при муковисцидозе ДНК-диагностика заболеваний, связанных с экспрессией тринуклеотидных повторов

• 
  Слайд 17

  Аллель-специфичная ПЦР

  Один из праймеров коплементарен мутантному аллелю, другой- нормальному.Обратный праймер – общий для двух реакций N M N M N M 1 2 3

• 
  Слайд 18

  Эндонуклеазы рестрикции

  Ферменты, узнающие определенные короткие (4-8 пн) последовательности в ДНК (сайты) и разрезающие двухцепочечную ДНК Пример:MspI (CCGG) GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT

• 
  Слайд 19

  ПДРФ анализ

  ----------------CCGG-------норма режет ----------------CCGA-------мутация не режет 400 пн 300 пн 100 пн MspI MspI узнает последовательность ’CCGG, соответствующую нормальному аллелю 400 пн 300 пн 100 пн

• 
  Слайд 20

  Пример: КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ

  Характеристика гена GALT локализация гена 9p13 11 экзонов Характеристика мутации Описано более 160 различных мутаций Мутации Q188R, K285N обуславливают тяжелый фенотип(самые частые мутации 70-80% аллелей) N314D обуславливает, т.н. вариант Дуарте S135L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка) 5’ экзоны:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

• 
  Слайд 21
  

  Характеристика гена GALT локализация гена 9p13 11 экзонов Характеристика мутации Описано более 160 различных мутаций Мутации Q188R, K285N обуславливают тяжелый фенотип(самые частые мутации 70-80% аллелей) N314D обуславливает, т.н. вариант Дуарте S135L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка) 5’ экзоны:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

• 
  Слайд 22
  

  Характеристика гена GALT локализация гена 9p13 11 экзонов Характеристика мутации Описано более 160 различных мутаций Мутации Q188R, K285N обуславливают тяжелый фенотип(самые частые мутации 70-80% аллелей) N314D обуславливает, т.н. вариант Дуарте S135L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка) 5’ экзоны:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

• 
  Слайд 23

  Мультиплексная ПЦР

  ПЦР с несколькими парами праймеров, соответствующих разным участкам гена Пример –ДНК-диагностика делеций при миодистрофии Дюшена

• 
  Слайд 24

  Методы поиска мутаций в генах

  SSCP-анализ Денатурирующий гель электрофорез или денатурирующая ВЭЖХ Секвенирование Биочипы Блотинг по Саузерну (детекция крупных перестроек)

• 
  Слайд 25

  SSCP-анализ

  Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК Замена даже одного нуклеотида приводит к измененим конформации цепей, что изменяет их электрофоретическую подвижность Чувствительность 70-80%

• 
  Слайд 26

  Гибридизация

  Комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников меченная ДНК –проба, зонд связывается с комплементарной ей последовательностью

• 
  Слайд 27

  Блотинг

  Саузерн-блотинг Рестрикция Разделение изучаемого фрагмента в геле Денатурация Перенос на мембрану Гибридизация с меченной пробой

• 
  Слайд 28

  Делеции мтДНК

  16500 пн N Del 8000 пн Del 12 000 пн 4500 пн 8500 пн

• 
  Слайд 29

  Биочипы

  Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов Олигонуклеотиды специфично гибридизуются с меченными молекулами ДНК

• 
  Слайд 30

  Секвенирование ДНК

• 
  Слайд 31

  Косвенная ДНК-диагностика

  Основана на анализе сцепления Анализ полиморфных маркеров ДНК 1 2 3 4 1 1 2 3 3 4

• 
  Слайд 32

  Вариабельность ДНК

  Около 99,7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны Около 0,3% (примерно 10 000 000 нуклеотидов) различаются между отдельными индивидами.

• 
  Слайд 33

  Полиморфные варианты ДНК

  Различия в последовательности ДНК (Однонуклеотидные полиморфизмы – SNP) -----------AGGCTG------------- -----------AAGCTG------------- Различия в длине последовательностей ----------AATG AATG---------------- ----------AATG AATG AATG-------

• 
  Слайд 34

  Повторяющиеся последовательности

  Сателлитная ДНК – размер повторяющегося элемента от нескольких сотен до нескольких тысяч пн Минисательтная ДНК (VNTR – variant number tandem repeats) размер повторяющегося элемента 10-100пн Микросательтная ДНК (STR – short tandem repeats) размер повторяющегося элемента 2-6 пн

• 
  Слайд 35

  Номенклатура ДНК-маркеров

  ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена обозначаются согласно их положению на хромосоме. D16S539 D – ДНК 16- хромосома S – единичная копия последовательности 539- 539 локус описанный на хромосоме 16

• 
  Слайд 36

  Выбор ДНК-маркеров

  Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах ) Расположенные близко к исследуемому гену. Фланкирующие ген с теломерной и центромерной сторон

• 
  Слайд 37
  

  Н М A1 A2 A3 A4 Н A1 A3 М A2 A4 Н М A1 A2 A4 A3 Расстояние оценивают в сантиморганидах (1СМ –1%- 1000 000 пн) Чем ближе расположены маркеры к гену, те чем теснее они сцеплены, тем ниже процент ошибки

• 
  Слайд 38
  

  ?

• 
  Слайд 39

  Пример

  99 пн 96 пн 105пн 90пн ?

• 
  Слайд 40
  

  99 пн 96 пн 105пн 90пн ?

• 
  Слайд 41
  

  99 пн 96 пн 105пн 90пн ?

• 
  Слайд 42

  ДНК-диагностика

  по возможности использовать несколько подходов к диагностике (например, прямые и косвенные) анализ семейного материала даже в случае прямой диагностики Контроль воспроизводимости результатов Контроль на загрязнение плодного материала материнским

• 
  Слайд 43

  Номенклатура ДНК-маркеров

  Если маркер находится внутри гена, то для обозначения используют сокращенное наименование гена HUMTH01 HUM- Геном человека TH-Ген тирозин гидроксилазы 01 –интрон 1 данного гена