Презентация на тему "Основы генной инженерии"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Основы генной инженерии

  Ферменты (продолжение) Векторы Лекция 2

• 
  Слайд 2

  Изомеры рестриктаз

  Изошизомеры Рестриктазы разных видов бактерий, узнающие одинаковые сайты рестрикции и одинаково их расщепляющие. Метилчувствительные рестриктазы: HpaII иMspI (CCGG) – первый не расщепляет ДНК, если хотя бы один из остатков C метилирован; N-метилирование остатков A – Sau3A (иGATCи GMeATC), DpnI (только GMeATC), MboI (только GATC) Гетерошизомеры Узнают одинаковые сайты рестрикции, но по-разному их расщепляют (KpnI - G↓GTACC, Asp7181 - GGTAC↓C) Изокаудомеры Узнают разные сайты рестрикции, но создают одинаковые липкие концы. Лигирование с потерей сайта рестрикции

• 
  Слайд 3

  Свойства, которыми должен обладать любой вектор

  Способность к длительному существованию в клетках-хозяевах (репликация автономная или в составе хромосом) Наличие биохимических или генетических маркеров, которые позволяют обнаруживать его присутствие в клетках Должны допускать встраивание чужеродной ДНК без нарушения своей функциональной целостности

• 
  Слайд 4

  Плазмидные векторы

• 
  Слайд 5

  Биологические свойства бактериальных плазмид, используемые в векторах

  Молекулярные эндосимбионты – автономная репликация Негативный контроль числа копий Низкокопийные (1-2 копии на клетку) Высококопийные (10-100 копий на клетку) Консервативность размера Минимальный размер определяется элементами внутриклеточной автономии Ограничения на размер вставки чужеродной ДНК Совместимость разных плазмид в клетке Группы несовместимости Случайная сегрегация в дочерние клетки

• 
  Слайд 6

  Плазмидный вектор pUC18

  bla– Ген β-лактамазы, селектируемый маркер (устойчивость ампициллину) ori–Точка начала репликации (origin) lacZ‘–N-концевая часть гена β-галактозидазы (кодирует146 из 1021 АК- остатков), селектируемый маркер (хромогенный субстрат X-Gal) lacI–Ген Lac-репрессора (Индуктор – IPTG) Полилинкер

• 
  Слайд 7

  Плазмидный вектор Bluescript

  Promega Фагмида(Phagemid)

• 
  Слайд 8

  Расщепление Xgalβ-галактозидазой

  Cl

• 
  Слайд 9

  Вектор для слияния генов pGEX-P-3

  Ген глутатион-S-трансферазы Иммобилизованный глутатион

• 
  Слайд 10

  Регуляция экспрессии генов в векторе pET

  Бактериальная клетка BL21DE Novagene

• 
  Слайд 11

  TA-Клонирование продуктов ПЦР

  Taq-ДНК-полимераза образует в продукте ПЦР 3’-выступающие A-концы

• 
  Слайд 12

  Побочные продукты лигирования вектора и вставки

  Кольцевые мономеры Линейные ди-, три-, … мультимеры Кольцевые димеры Рекомбинантная плазмида

• 
  Слайд 13
  

  Предотвращение образования плазмидного вектора без вставки с помощью щелочной фосфатазы

  5’ Лигирование, трансформация 5’ 5’

• 
  Слайд 14

  Векторы на основе хромосомы фага λ

• 
  Слайд 15

  Жизненный цикл фага λ

  Два пути развития бактериофага: Лизогенный: интеграция в хромосому хозяина Литический: а) Двухсторонняя θ-репликация; б) Катящееся кольцо

• 
  Слайд 16

  Репликация ДНКфага λ

  cos-Сайты ДНК фага λ cohesivesites, 12 п.н.

• 
  Слайд 17

  Упаковка ДНК фага λin vitro

  Лизогенные штаммы E. coli Штамм 1 Штамм 2 Смесь экстрактов клеток двух штаммов содержит все компоненты капсида фага λ Жизнеспособный фаг λ

• 
  Слайд 18

  Инсерционный вектор лямбда gt10

  Вставка чужеродной ДНК до 7.6 т.п.о. по EcoRI-сайту

• 
  Слайд 19

  Использование вектора лямбда EMBL4 с замещением внутренней области

• 
  Слайд 20

  Космидный вектор (космида)с2XB

• 
  Слайд 21

  Искусственные хромосомы

• 
  Слайд 22

  Искусственная хромосома дрожжей YAC(Yeast Artificial Chromosome)

  >2000 т.п.н. ura3 – ген оротидин- 5’-фосфатдекарбоксилазы жизненноважный: позитивный отбор 5-фтороротовая кислота (нетоксична) 5-фторурацил (токсичен) негативный отбор

• 
  Слайд 23

  Бактериальная искусственная хромосома (BAC)

  Cmr oriS repE parA parB parA, parB– контроль числа копий (1-2) Cmr – селектируемый маркер oriS, repE – односторонняя репликация cosN– сайт терминазы λ loxP – cre-рекомбиназа фага P1 cosN loxP Емкость – 300 т.п.н. Стабилен на протяжении 100 генераций

• 
  Слайд 24

  Клонирование ДНК с помощью BAC

• 
  Слайд 25

  Получение искусственных хромосом животных методом «сверху-вниз»

• 
  Слайд 26

  Евгений Витальевич Ананьев, 1970-е

  Искусственные хромосомы кукурузы Первооткрыватель мобильных генетических элементов у дрозофилы

• 
  Слайд 27
  

  Внехромосомные (эписомные) векторыдля экспрессии рекомбинантных генов в клетках животных

  Челночный эписомный вектор на основе вируса Эпштейна-Барр EBNA1 – Epstein-Barr nuclear antigen 1 OriP – Область начала репликации в клетках животных ORI – Область начала репликации в бактериальных клетках AMP – Ген устойчивости к ампициллину polyA – сайт полиаденилирования 20-300 копий на клетку. Стабильно распределяются между дочерними клетками.

• 
  Слайд 28

  Емкости векторов разных классов

• 
  Слайд 29

  Способы введения ДНК в бактериальные клетки

  Трансформация 107- 108 колоний/мкг ДНК каналы, холодовой шок, ионы магния, рубидия гексаминкобальтхлорид Трансфекция Электропорация 109- 1010 колоний/мкг ДНК шок электрическим полем высокой напряженности (3-5 мс), поляризация мембран, обратимое повреждение