Содержание
-
Characterization of crop varieties by seed storage protein electrophoresis(Характеристика сортов сельскохозяйственных культур методом электрофореза запасных белков семян)
Выполнила: Борцова Светлана, Магистрант 1 года МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени первого Президента России Б. Н. Ельцина ИНСТИТУТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК Департамент «БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ» Кафедра физиологии и биохимии растений Екатеринбург 2014
-
Запасные белки семян
- белки, в больших количествах накапливающиеся в белковых тельцах внутри семян. Служат источником аминокислот в процессе прорастания семени. Для биотехнологии представляют интерес: 1. Как основной источник пищевого белка для человека и животных; 2. Как модель системы экспрессии.
-
Типы белков семянНаиболее удобную и распространнненную классификацию белков семян, основанную на их различной растворимости, предложил Т.Б. Осборн.Выделяют 4 типа белков:
а) альбумины, водорастворимые и включающие в себя в основном белки-ферменты; б) глобулины, растворимые в разнообразных растворах солей и присутствующие в мембран-связанных белковых телах,т.е. это запасные белки в строгом смысле этого слова; в) проламины, растворимые в водно-спиртовых растворах и также являющиеся истинно-запасными белками; г) глютеины, растворимые в кислых или щелочных растворах и являющиеся в основном структурными или запасными белками, хотя некоторые из них могут иметь метаболические функции
-
-
-
Проламины делятся на две группы: серосодержащие (S-богатые) и серо-несодержащие (S-бедные). Все эти белки кодируются семействами родственных генов, имеющих общего предшественника. Часто к П. относят также родственные им белки-глютенины (глутелины, или HMW). Все эти группы белков различаются по аминокислотному составу, содержат много остатков глутамина и пролина, мало остатков основных аминокислот
-
Методы изучения должны основываться на изучении семян, а результаты анализов не должны зависеть от условий выращивания растений, режимов и сроков хранения. Широко применяется метод генетических маркеров. Основой для этого метода стал "метод сигналей", разработанный А. С. Серебровским
-
-
-
Законом "О семеноводстве" для определения сортовых качеств семян сельскохозяйственных растений наряду с апробацией и грунтовым контролем предусмотрено введение лабораторного сортового контроля элитных и репродукционных семян, поступающих в оборот. Для этого необходимо иметь достаточно быстрые и дешевые методы, использующие в анализе семяна, а не растения, и неопирающиеся на описание морфологии. К ним относятся, прежде всего, электрофоретические методы анализа белков семян.
-
С использованием различных методов электрофореза показано наличие генетически обусловленного полиморфизма многих белков семян, во много раз превышающего разнообразие по морфологическим признакам. Это навело на мысль о возможности использования таких белковых систем для дифференциации сортов и определении сортовой чистоты семян.
-
У ячменя для идентификации сортов все большее распространение получают различные методы электрофореза спирторастворимых белков зерна - гордеинов
Это обусловлено следующими причинами: - гордеины чрезвычайно полиморфны и их электрофоретические спектры высоко сортоспецифичны; - электрофореграммыгордеинов стабильны и не зависят от условий выращивания, длительности и условий хранения семян; - доля гордеинов в суммарном белке зерна может достигать 50% и они легко выделяются; - некоторые существующие методики электрофореза гордеинов пригодны для массовых анализов; - генетический контроль гордеинов хорошо изучен.
-
При электрофорезе в кислой среде на крахмальном или полиакриламидном геле глиадины делятся по подвижности на a-, b-, g- и w-группы, каждая из которых включает неск. белков. Гордеины делятся на С и В группы. Причем малоподвижные белки группы В-это S-бедные проламины. Глютенины при обычных условиях электрофореза остаются на старте. При двухмерном электрофорезе глиадинов выделено более 50 компонентов, причем разные сорта пшеницы существенно различаются по составу белков, относящихся к проламинам.
-
Важнейшей частью метода анализа гордеинов для целей определения сортовой чистоты и подлинности семян являются способы интерпретации результатов. Здесь существует два подхода. Первый -"биохимический", основанный лишь на учете количества электрофоретических компонентов белков и определении их относительной электрофоретической подвижности в сравнении с каким-либо эталоном. Второй подход основан на знании наследования и генетического контроля белков. С использованием генетического подхода созданы каталоги вариантов гордеинов для сотен сортов мировой колекции, позволяющий записывать электрофореграммыгордеинов в виде генетических формул. Однако современные сорта ячменя, выращивающиеся на территории Российской Федерации оказываются практически не исследованными по гордеинам. Из-за того, что используются разные методики, часто происходит недопонимание и дискредитация метода электрофореза
-
Электрофорез в ПААГ
В присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия – (в денатурирующих условиях) ДДС-Na-ПААГ электрофорез Двумерный электрофорез (2D электрофорез)
-
Двумерный электрофорез (2DE – twodimensionalelectrophoresis) представляет собой метод разделения смеси белков, основанный на последовательном использовании двух свойств белков: заряда и массы. Использование таких не связанных между собой свойств белков необходимо, чтобы разделение смеси белков было максимальным. Во время проведения первого направления (еще называемого изоэлектрофокусированием, IEF) разделение белков основано на таком их свойстве, как изоэлектрическая точка (pI – isoelectricpoint). Изоэлектрическая точка определяется аминокисотным составом белка, и меняется при посттрансляционных модификациях. Когда белок попадает в гель с градиентом pH, к которому приложено электрическое поле, он начинает двигаться к электроду с противоположным зарядом: положительно заряженные белки перемещаются к катоду (отрицательно заряженный электрод), а отрицательно заряженные к аноду (положительно заряженный электрод). Во время миграции белок присоединяет или теряет протоны, в результате чего его заряд и подвижность снижается, и становится нулевой при достижении точки в градиенте pH, равной его pI. В этой точке он считается «сфокусированным», а на геле он выглядит как четко очерченное пятно. С помощью 2DE возможно разделить белки с очень близкими pI.
-
Далее гель, полученный в ходе изоэлектрофокусирования кладут горизонтально на вершину полимеризованного между двумя стеклами геля, и начинается второе направление, в ходе которого разделение основано на массе белков (рис. 1). В результате белки представлены на электрофореграмме в виде пятен, идентификация конкретных белков проводится с помощью масс-спектрометрии.
-
Анализ гелей, полученных в результате 2DE, более сложный по сравнению с анализом гелей, полученных в ходе 1DE из-за большего количества выделенных белков. Но это же является и значительным преимуществом 2DE по сравнению с одномерным электрофорезом: одновременно можно анализировать несколько белков, которые совместно экспрессируются в ходе изучаемого биологического процесса.
-
sodium dodecylsulphatepolyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE)
-
